SN_T 1146-2010烟草环斑病毒检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1146—2010代替SN/T1146-2002烟草环斑病毒检疫鉴定方法Detection and identification of tobacco ringspot virus2010-05-27发布2010-12-01实施中华人民共和国HH发布e国家质量监督检验检疫总局效碎防 SN/T 1146—2010前 言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草，本标准代替SN/T1146一2002《烟草环斑病毒检疫鉴定方法》。本标准与SN/T1146--2002相比，主要技术变化如下：现场检疫抽样按照SN/T2122一2008《进出境植物及植物产品检疫抽样》执行（见6.2）；删除了原标准规范性附录A；增加了“症状检查”一节（见6.3）；免疫电镜方法按照SN/T1840一2006《植物病毒免疫电镜检测方法》标准（见7.3）。本标推由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标推主要起草人：陈枝楠、邓琼、郑耘、凌杏园、郑文华、王东勇。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1146—2002。 SN/T 1146—2010烟草环斑病毒检疫鉴定方法1范围P本标准规定了进出境植物检疫中对烟草环斑病毒的检疫鉴定方法。本标准适用于进出境植物及其产品中烟草环斑病毒的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样规则3原理烟草环斑病毒（tobacco ringspptvirus，简称TRSV），异名为银莲花坏死病毒（anemone necrosisvirus）、蓝药坏死环斑病毒（blueberrynecroticringspot-virus)烟草珠斑病毒1号（tobacco ringspotvirus1）。该病毒为等轴多面体球状病毒，直径为25nm29nm，属线虫传多面体病毒属成员，可侵染54科、300多种植物，其中主要的经济作物有豆类、高铃薯、甘薯、烟草、西瓜、黄瓜、甜瓜、胡萝卜、唐菖蒲、百合、鸢尾、李属、苹果、葡萄、甜樱桃等。受TRSV侵染的植株症状因寄主而异，通常叶片出现环状或线状纹、褪绿斑或斑驳、坏死斑；粮腐烂、琴顶枯所结的果形等。该病毒主要依靠线虫和种子进行传播，主要分布于北美洲、大洋洲（欧洲、非洲等地区，具有寄主广泛，危害症状明显、免疫原性强、容易制备高滴度、专化性强的病毒抗血清等特点（参见附录A)/通过血清学双抗体夹心法(DAS-ELISA)结合鉴别寄主生物学鉴定方法或免疫电镜检测，作为检疫工作中鉴定该病毒的依据。4用具、设备、设施研钵、微量榨汁机、酶标仪、低速离心机（转速为4000rmin)、生物培养箱（具有光照，温度可调范围为0℃～50℃）、酶联板（48孔或96孔）、Eppendorf管（体积为1.5ml）、单道移液器（10μL、100uL、1000μL）、8道移液器（100uL或200μL）、恒温水浴锅或恒温培养箱、分析电子天平、pH计、白瓷盘（40cm×50cm）、钝头镊子、隔离检疫温（网）室。5试剂5.110×PBST缓冲液将氯化钠(NaCI)80g、磷酸二氢钾（KH,PO）2g、磷酸氢二钠（NazHPO,）11.5g、氯化钾（KCI）2g、吐温-20(Tween-20)5mL溶于蒸馏水，定容至1000mlL。5.2样品提取缓冲液将亚硫酸钠（Na2SO）1.3g、聚乙烯基吡咯烷酮（MW24000～40000，PVP)20g、叠氮钠（NaNs） SN/T 1146—20100.2g、吐温-20（Tween-20)20mL溶解于1000mLPBST中，用浓盐酸（HCI)调节pH值至7.4.并储存于4℃。5.3包被缓冲液将碳酸钠（NazCOs)1.59g、碳酸氢钠（NaHCO：）2.93g、叠氮钠（NaN3）0.2g溶解于1000mL蒸馏水中，用浓盐酸（HCI)调节pH值至9.6，并储存于4℃。5.4洗涤缓冲液将1×PBST缓冲液用浓盐酸(HCI)调节pH值至7.4，并储存于4℃。5.5酶标结合物缓冲液将1×PBST缓冲液800mL、小牛血清白蛋白（BSA）2g、PVP(MW24000～40000)20g、叠氮钠(NaN.）0.2g用蒸馏水定容至1000mL，并储存于4℃。5.6pNPP底物缓冲液将二乙醇胺97mL、叠氮钠(NaN:)0.2g溶解于1000mL蒸馏水中，用浓盐酸（HCI)调节pH值至9.8，并储存于4℃。5.7pNPP底物溶液将4-硝基酚磷酸钠盐（简称为pNPP)100mg溶解于pNP