SNT 1446.2-2006猪传染性胃肠炎血清中和试验操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1446.2—2006猪传染性胃肠炎血清中和试验操作规程Protocol of serum neutralisation test for swine transmissible gastroenteritis2006-04-25 发布2006-11-15 实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局码纺伪 SN/T 1446.2—2006前言SN/T1446共分为两个部分：猪传染性胃肠炎阻断酶联免疫吸附试验；猪传染性胃肠炎血清中和试验操作规程。本部分为SN/T1446的第2部分。本部分的附录 A和附录 B均为资料性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局。本部分起草人：罗琼、田纯见、李力施。本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1446.2--2006猪传染性胃肠炎血清中和试验操作规程1范围SN/T1446的本部分规定了猪传染性胃肠炎血清中和试验的操作技术要求。本部分适用于猪传染性胃肠炎血清中和抗体水平的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过SN/T1446的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于SN/T1446的本部分。3.1EDTA乙二胺四乙酸二钠。3. 2TCIDso半数组织细胞感染量。3. 3ST猪睾丸传代细胞。3. 4PK-15猪肾传代细胞。3. 5CPE细胞病变。3.6TGE猪传染性胃肠炎病毒。4材料准备4.1器材4.1.1无菌96孔平底组织培养板。4.1.2无菌24孔平底组织培养板。4.1.3细胞培养瓶。4.1.4微量可调移液器。 SN/T 1446.2—20064.1.5灭菌常规玻璃器材。4.1.6二氧化碳培养箱。4.1.7电热恒温水浴箱。4.1.8超净工作台。4.1.9倒置显微镜。4.1.10200μL～1 000 μL 灭菌吸嘴。4.2试剂4.2.1稀释液配制方法参见附录 A的第 A.1章。4.2.2细胞生长液配制方法参见附录A的第A.2章。4.2.3细胞消化液配制方法参见附录A的第A.3章。4.2.4细胞维持液配制方法参见附录A的第A.4章4.2.5水本部分所用水应符合,GB/T6682标准中的二级水的规格4.3试验材料4.3.1细胞猪睾丸传代细胞或 PK-15 细胞。4.3.2 TGE 病毒Miller株或经权威机构认可的毒株。4.3.3血清标准阳性血清效价不低于1：32，由指定单位提供，按说明书使用。4. 3.3. 2标准阴性血清不含TGE抗体的健康猪血清，由指定单位提供,按说明书使用。待检血清无菌采血并分离出血清,待检血清至少不得少于1.mL,置一20℃保存。5预备试验5.1细胞培养T按常规方法培养细胞(ST或PK-15)：5.2 病毒增殖在PK-15细胞或ST细胞形成单层后，倒掉细胞生长液;按接种量约为生长液的1：10的比例将猪TGE 病毒液接种到适当的细胞单层上;将细胞瓶迅速翻转使病毒液充分浸没细胞单层置 37℃ 5%二氧化碳吸附1h，然后加人细胞维持液。置37℃5%二氧化碳培养箱培养,逐日观察。当75%至80%细胞出现病变时,冻融细胞瓶三次，然后分装液体，置一70℃或液氮保存备用。5.3毒价测定首先将一份TGE种毒用稀释液作10倍系列稀释，从10-1～10-8。然后在96孔平底组织培养板上先每孔加人50uL稀释液,再加人等量的各稀释度的病毒悬液，每个稀释度作8孔，设正常细胞对照4孔（每孔含稀释液100μL，细胞悬液100μL），最后将生长良好的ST或PK-15细胞经细胞消化液消化2 SN/T 1446.2—2006后，用细胞维持液将细胞配成悬液，按100μL/孔（细胞含量约为每毫升3×105个细胞)加人各孔内。置 37℃ 5%二氧化碳培养箱培养3 d～7d,记录各病毒稀释度的细胞病变孔数。用Karber方法计算每50 μL中 TCIDso（参见附录 B)。5.4血清处理待检血清、标准阳性和阴性血清置56℃水浴箱内灭活30 min。6正式试验6.1血清稀释在96孔板上将每份被检血清用稀释液作1：2、1：4、1：8、1：16稀释，每个稀释度为双孔，每份血清8个孔，每孔50μL,其中1：2稀释的第一孔设为血清毒性对照孔。6.2 工作病毒液的滴加根据已知病毒液效价,将病毒液稀释成每50μL含100 TCIDs。的工作病毒液。按每孔50μL加人各孔内，血清对照孔内不加工作病毒液,加50αL稀释液，振荡均匀。置