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中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2754.12—2011出口食品中致病菌环介导恒温扩增(LAMP)检测方法第12部分:溶藻弧菌Loop-mediated isothermal amplification detection method for pathogensin export food-Part 12 :Vibrio alginolyticus2011-07-01 实施2011-02-25 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局
SN/T 2754.12—2011前言SN/T2754《出口食品中致病菌环介导恒温扩增(ILAMP)检测方法》共分为15个部分:第1部分:金黄色葡萄球菌;第2部分:大肠杆菌0157;第3部分:志贺氏菌;第4部分:单核细胞增生李斯特菌;第5部分:副溶血性弧菌;第6部分:小肠结肠炎耶尔森氏菌;第7部分:空肠弯曲菌;第8部分:肺炎克雷伯氏菌;第9部分:溶血性链球菌;第10部分:产气荚膜梭菌;第11部分:产霍乱毒素的霍乱弧菌;第12部分:溶藻弧菌;第13部分:创伤弧菌;-第14部分:假结核耶尔森氏菌;1第15部分:阪崎肠杆菌。本部分为SN/T 2754的第12部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国湖北出人境检验检疫局、中华人民共和国珠海出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏盐城出人境检验检疫局、中华人民共和国重庆出人境检验检疫局、广州华峰生物科技有限公司。本部分主要起草人:魏海燕、曾静、李志勇、曾宪东、冯家望、郑文杰、徐帮兴、易敏英、谭志、曹以诚、高东微。
SN/T 2754.12--2011出口食品中致病菌环介导恒温扩增(LAMP)检测方法第12部分:溶藻弧菌1范围SN/T2754的本部分规定了检测出口食品中溶藻弧菌的环芥导恒温核酸扩增(LAMP)法。本部分适用于出口食品中溶藻弧菌的筛选检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测NMKL No.156食品中致病性弧菌的检测和计数3生物安全措施为了保护实验室人员的安金,应由具备资格的工作人员检测溶藻弧菌,所有培养物和废弃物应按照GB19489 中的有关规定执行4防污染措施防止污染措施应符合GB/T27403的规定5 缩略语下列缩略语适用于本文件。Betaine:甜菜碱Bst 酶[Bst DNA polymerase(large fragment)]:Bst/DNA 聚合酶(大片段)CT(cholera toxin):霍乱毒素DNA(deoxyribonucleric acid):脱氧核糖核酸dNTP(deoxyribonucleoside triphosphate):脱氧核苷三磷酸EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid):乙二胺四乙酸LAMP(loop-mediated isothermal amplification):环介导恒温扩增Triton X-100:聚乙二醇辛基苯基醚
SN/T 2754.12--20116技术概要根据溶藻弧菌胶原酶基因序列(参见附录 A)设计特异性内引物、外引物各一对和一条环状引物,特异性识别靶序列上的7个独立区域。利用Bst 酶启动循环链置换反应,在胶原酶基因序列启动瓦补链合成,在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环 DNA混合物;从 dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²+结合,产生副产物(焦磷酸镁)形成乳白色沉淀,加人显色液,即可通过颜色变化观察判定结果。试剂和材料除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯;实验用水符合GB/T 6682中一级水的要求。7.1引物:根据溶藻弧菌属特有的靶序列设计一套特异性引物,包括外引物1,外引物2,内引物1,内引物2和环状引物。外引物扩增片段长度:215bp。外引物 1(F3,5′-3):CAGCACGCGTACTTACCG外弓物 2(B3,5′-3):TCAGCACCGATTGATGACG内引物 1(FIP,5′-3’): TTGCGCATATACCAGTGCTGGGTTTTCAAGTGACCCAGTGGCTTAC引物 2(BIP,5′-3’): TGGGCAG
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