NY_T 2252-2012槟榔黄化病病原物分子检测技术规范.pdf

ICS 65.020B 16NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2252—2012槟榔黄化病病原物分子检测技术规范Molecular detection for pathogen of arecanut yellow leaf disease2013-03-01实施2012-12-07发布中华人民共和国农业部发布 NY/T 2252—2012前言本标准按照GB/T1.1给出的规则起草。本标准由农业部农垦局提出。本标准由农业部热带作物及制品标准化委员会归口。本标准起草单位：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。本标准主要起草人：罗大全、车海彦、温衍生、徐雪莲。I NY/T2252—2012槟榔黄化病病原物分子检测技术规范1范围本标准规定了槟榔黄化病病原物的检测方法本标准适用于槟榔植株中黄化病病原物的定性检测2术语和定义PUBLISHINGK下列术语和定义适用于本文NDARD2. 1植原体phytoplasmaaD寄生于植物韧皮部筛管和介GRESE结构的康内的，具有三层单位壁的原核生物，一般引起奇形等症植物叶片黄化和发育响2. 2S槟榔黄化病arecanutyellow leaf diseasem起的一种由植原体引起槟榔病害该病害病原菌的分类地位、寄主范围、EARCH状及地理分布见D. 1~D. 4。2. 3聚合酶链式反应polymerase chain reaction,PCR模板基因序利先经左DNAI海作用和适宜的反根据模板序列设A件成单链·在别与模退火而互相结接着者计的两条引物分序列发在DNA聚合NA两条链上相应的酶的作用下以脱拿氧核糖核酸（dNTP）为底物·使引物得以延伸，重风四种后不断退火和延伸这ENTER一循环，使欲扩增段以2. 4R巢式聚合酶链式反应nestedPCR,巢式PCR[物对人巢式物）进行两轮PCR扩增反应，首先用一对奶利用两套PCR物进行第一轮PCR扩第一对引物扩增的DNA序列内部的一对内引物再次护增。增，然后再使用第3原理利用植原体通用引物R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2，对待检样品进行巢式PCR扩增，依据扩增的片段序列的限制性片段长度多态性ntlengthpolymorphism，RFLP)图谱是否与槟榔黄化植原体核糖体DNA(16SrDNA)序列的RFLP图谱一致，判断样品中是否存在槟榔黄化植原体。4巢式PCR检测所用仪器，试剂和方法见附录A。5巢式PCR检测5.1田间取样根据附录D.3和D.4的描述，初步确定槟榔植株是否为槟榔黄化病疑似病株。田间取疑似槟榔植1 NY/T2252—2012株及未表现症状的植株嫩叶约200g，放人自封袋中，送实验室检测。5.2槟榔植株叶片总DNA提取取相应样品叶脉0.5g，加入适量液氮研磨呈粉状，再加入1mLDNA提取缓冲液充分研磨，然后加人80μL10%十二烷基肌氨酸钠（NLS)，混匀，55℃温育1h~2h，4℃4300×g离心10min，取上清液；加人2/3上清液体积异丙醇，轻轻混匀，一20℃保持30min，4℃7700×g离心15min，弃上清；加人600μLTE缓冲液、30μL10%十二烷基硫酸钠（SDS）和3μL蛋白酶K（20mg/mL），轻轻彻底悬浮沉淀，37℃温育30min～60min；加100μL5mol/LNaCl混匀，再加入84μL十六烷基三甲基溴化铵/氯化钠（CTAB/NaCI)溶液混匀，65℃温育10min；加人等体积氯仿：异戊醇（24：1)混匀，4℃4300×g离心5min，重复直至无中间白色层；取上清液，加人等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），混匀，4℃4300×g离心5min；取上清液，加人2/3体积异丙醇，混匀，一20℃保持30min，4℃17000×g离心10min，弃上清液；加入500μL70%乙醇洗涤，4℃17000×g离心10min，洗涤两次；取沉淀，加人50μLTE缓冲液混匀溶解。加人5μLRNA酶A（RNaseA，10mg/mL)，37℃静置30min，除去RNA，一20℃保存备用。5.3引物序列引物采用植原体16SrDNA通用引物R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2，引物序列见表1。表1巢式PCR检测的引物序列引物名称引物序列5-3R16mF2CATGCAAGTCGAACGGAR16mR1CTTAACCCCAATCATCGACR16F2nACGACTGCTAAGACTGGR16R2GCGGTGTGTACAAACCCCG5.4PCR反应待检样品检测反应均需同时以槟榔黄化植原体16SrDNA质粒（碱基序列参见附录D.8)作为阳性对照，未见症状的槟榔植株种子的胚组织提取的DNA作为阴性对照，无菌双蒸水作为空白对照。PCR反应体系见表2。表2PCR反应体系组分加样量，μL10XPC