NY_T 2729-2015李属坏死环斑病毒检测规程.pdf

ICS 65.020B 16NY中华人民共和国农业行业标准NY/T2729—2015李属坏死环斑病毒检测规程Criterion for prunus necrotic ringspot virus detection2015-05-21发布2015-08-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T2729—2015前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由农业部种植业管理司提出并归口。本标准起草单位：农业部花卉产品质量监督检验测试中心（昆明）、云南省农业科学院花卉研究所国家观赏园艺工程技术研究中心、云南省花卉育种重点实验室、云南省花卉工程技术研究中心。本标准起草人：王丽花、翟素萍、王继华、杨秀梅、吴学尉、王其刚、张艺萍、张丽芳、苏艳、彭绿春I NY/T2729—2015李属坏死环斑病毒检测规程1范围本标准规定了李属坏死环斑病毒（Prunusnecroticringspotuirus，PNRSV)的双抗体夹心酶联免疫吸附检测法(DAS-ELISA)和指示植物检测法。本标准适用于植物组织中李属坏死环斑病毒的检测。2取样根据样品属性，取发芽幼苗、腋芽、枝条韧皮部、果实表皮、叶片、鳞片外表皮等器官或组织，洁净水洗净后备用。3检测方法3.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(DAS-ELISA)3.1.1原理利用抗原（病毒）与其特异性抗体在离体条件下产生专一性反应的原理。即存在于样品中的病毒颗粒首先被吸附在酶联板孔中的单克隆抗体捕捉后，再与碱性磷酸酯酶标二抗结合反应，后加人碱性磷酸酶底物，酶将底物水解并产生有色产物。颜色的深浅与样品中病毒的含量成正比，若样品不携带病毒则无颜色反应。3.1.2仪器、用具及耗材酶标仪（配405nm滤光片），恒温培养箱（温度可调范围0℃～40℃），生物培养箱（具光照、温度可调范围0℃～50℃），电子天平（感量为0.01g、0.0001g），酸度计。微量移液器（200μL～1000μuL，10μL～100μL，0.5uL～10μuL），酶联板，研钵或自封袋，微量移液器吸头，离心管等。3.1.3试剂所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。抗体和对照PNRSV抗体、阳性对照、阴性对照或DAS-ELISA检测试剂盒均来自市售。包被缓冲液(pH9.6,贮藏于4℃)碳酸钠（Na2CO:）1.59 g2.93 g碳酸氢钠（NaHCO3）0.2 g叠氮化钠（NaN:）加蒸馏水溶解定容至1000mL。洗涤缓冲液(PBST,pH7.4)氯化钠(NaCI)8.0 g0.2 g无水磷酸二氢钾（KH2PO4）无水磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.15 g氯化钾(KCI)0.2 g0.5 g吐温-20（Tween-20）加蒸馏水溶解定容至1000mL。样品提取缓冲液(GEB,pH7.4，贮藏于4℃）1 NY/T2729—2015脱脂奶粉2.0g聚乙烯吡咯烷酮（PVP，MW24000~40000）20.0 g无水亚硫酸钠（Na2SO3）1.3g叠氮化钠（NaN:）0.2 g吐温-20（Tween-20）20. 0 g溶于PBST中，定容至1000mL。酶标抗体稀释缓冲液（EC1,pH7.4,贮藏于4℃）牛血清白蛋白(BSA)2.0 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP，MW20.0g40000）叠氮化钠（NaN3）28溶于PBST中，定容至1omPUBLISHINGAARDC-底物缓冲液(PNpH9二乙醇胺ANDA六水氯化镁NaN3RESE0.2gAA溶于800mL底物溶见用奶配硝基苯根据需要称LVE钢夜。mol/1ARCH终止氧化钠溶液A称取120gH0001蒸馅水3.1.4操作步D包被抗1人ICENT在酶标板孔包好放入湿盒中，置于4℃冰为孵有试样制行C将待测试样和袋中磨碎至匀浆，后转入离心管阴照的上清液制拉带照·阴性备同上，阳性样品为日为已知的不携带时照任的阴PNRSV的材料或试剂洗板孵育结束后，将孔内液快，小出，每孔BST清洗次，每次停留1min～2min。清洗完成后在洁净吸水纸上孔内残液包被试样吸取的上清液加入清洗完成后的酶匕加100uL，每个待测样品设置重复，同时设阳性对照、空白对照和阴性对照。将酶标板用保鲜膜包好放人湿盒中，4℃冰箱内孵育过夜或21℃~24℃下孵育2.0h~2.5h。洗板同。包被酶标抗体包被前按酶标抗体稀释比例在干净玻璃管或聚乙烯管中加人一定体积的EC1和酶标抗体充分混匀，酶标板每孔加100uL，完成后将酶标板用保鲜膜包好放人湿盒，21℃～24℃下孵育2.0h～2.5h。洗板2 NY/T2729—2015同。加底物溶液每孔加人100uL配制好的底物溶液。酶标板用保鲜膜包好放人湿盒中21℃～24℃下蔽光显色30min～60min。显色达到要求后，每孔加人50uL终止液终止反应。酶标仪读数终止反应20min内，将酶标板置于