NY 679-2003猪繁殖与呼吸综合征免疫酶试验方法.pdf

ICS 11.220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 679—2003猪繁殖与呼吸综合症免疫酶试验方法 Enzyme immunoassay for porcine reproductive and respiratory syndrome2003-07-30 发布2003-10-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 679—2003前 本标准的附录 A 为规范性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出并归口。本标准起草单位：农业部兽医诊断中心。本标准主要起草人：王宏伟、主传彬、陈西钊、田克恭。 NY/T 679--2003猪繁殖与呼吸综合症免疫酶试验方法1范围本标准规定了猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)免疫酶试验和免疫酶组织化学方法。本标准适用于检测猪血清中的猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)抗体和组织中的 PRRSV 抗原。2 免疫酶试验2.1材料准备2. 1. 1 试剂磷酸盐缓冲液(PBS):配制见第 A.1章。抗原涂片的制备:PRRSV接种于生长至 70%～80%单层的Marc-145细胞。接种后 3d～~4 d,病变达50%～75%时,用胰蛋白酶消化分散感染的细胞单层,PBS洗涤三次后,稀释至 1X10°个细胞/mL。取印有10个～40个小孔的室玻片，每孔滴加10 μL。室温自然干燥后,冷丙酮（4℃）固定10 min。密封包装，置一20℃备用。标准阳性血清:PRRSV试验感染猪制备的血清。2.1. 1. 4 标准阴性血清:无 PRRSV 感染、未经免疫的猪血清。酶结合物：辣根过氧化物酶(HRP)标记的葡萄球菌 A蛋白(SPA)。底物溶液：配制见第A.2章。2.1.2器材a）普通光学显微镜；b)）|印有10个～40个小孔的室玻片；c）微量加样器,容量5μL～50μL;d）37℃恒温培养箱或水浴箱。2.1.3样品采集被检猪血液,分离血清。血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4℃或一30℃保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用 PBS作 10 倍稀释。2.2操作方法2.2.1取出抗原涂片,室温干燥后,滴加 10 倍稀释的待检血清和标准阴性血清、标准阳性血清,每份血清加两个病毒细胞孔和一个正常细胞孔，置湿盒内,37℃ 30 min。2.2.2PBS漂洗三次，每次 5 min，室温干燥。2.2.3滴加适当稀释的酶结合物，置湿盒内，37℃ 30min。2.2.4PBS 漂洗三次,每次 5 min。2.2.5 将室玻片放人底物溶液中,室温下显色 5 min～10 min。PBS 漂洗两次,再用蒸馏水漂洗一次。2.2.6吹干后,在普通光学显微镜下观察,判定结果。2.3 结果判定2.3.1在阴性血清对照、阳性血清对照成立的情况下:即阴性血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均无色；阳性血清与正常细胞反应无色，与病毒感染细胞反应呈棕黄色至棕褐色，即可判定结果；否则应重试。2.3.2待检血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均呈无色，即可判为PRRSV抗体阴性。2.3.3待检血清与正常细胞反应呈无色，而与病毒感染细胞反应呈棕黄色至棕褐色，即可判为1 NY/T 679—2003PRRSV抗体阳性。3免疫酶组织化学法3.1材料准备3.1.1 试剂磷酸盐缓冲液(PBS)：配制见第A.1章。标准阳性血清：PRRSV实验感染猪制备的血清。标准阴性血清：无 PRRSV感染、未经免疫的猪血清。酶结合物：HRP标记的 SPA。5底物溶液：配制见第A.2章。3. 1. 1. 过氧化氢甲醇溶液：配制见第A.3章。盐酸酒精溶液：配制见第A.4章。胰蛋白酶溶液：配制见第A.5章。3. 1. 器材a）普通光学显微镜；b)微量加样器，容量50μL～200μL；石蜡切片机或冷冻切片机；c)d）载玻片及盖玻片；e）37℃恒温培养箱或水浴箱3.1.3样品对疑似PRRS的病死猪或扑杀猪,立即采集肺、扁桃体和脾等组织数小块，置冰瓶内立即送检。不能立即送检者，将组织块切成1cm×1cm左右大小，置体积分数为10%的福尔马林溶液中固定，保存，送检。3.2操作方法3.2.1新鲜组织按常规方法制备冰冻切片。冰冻切片风干后用丙酮固定10min～15min;新鲜组织或固定组织按常规方法制备石蜡切片，常规脱蜡至PBS（切片应用白胶或铬矾明胶做粘合剂，以防脱片）。3.2.2去内源酶：用过氧化氢甲醇溶液或盐酸酒精37℃作用20min。3.2.3胰蛋白酶消化：室温下，用胰蛋白酶溶液消化处理2 min，以便充分暴露抗原。3.2.4漂洗:PBS 漂洗三次 每次 5 min。3.2.5封闭：滴加体积分数为5%的新生牛血清或1：10稀释的正常马血清，37℃湿盒中作用30min。3.2.6加适当稀释的标准阳性血清或标准阴性血清,37℃湿盒中作用1 h 或 37℃湿盒中作用 30