SN 1632.3-2005奶粉中阪岐肠杆菌检验方法 第3部分：荧光PCR方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1632.3—2005奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第 3部分：荧光 PCR方法Detection of Enterobacter sakazakii from dehydrated powdered milk-Part 3 : Real-time PCR method2005-08-18 发布2006-02-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1632. 3—2005前言SN/T1632《奶粉中阪崎肠杆菌检验方法》分为三个部分：第1部分：分离与计数方法；第2部分：PCR方法；-第3部分:荧光PCR方法。本部分为SN/T1632的第3部分。本部分的附录 A、附录B为规范性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳太太基因工程有限公司。本部分起草人：吕敬章、赵贵明、谢丽琪、郑卫平、林镜中、肖性龙。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。I SN/T 1632.3—2005奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第3部分：荧光PCR方法1 范围SN/T1632的本部分规定了奶粉中阪崎肠杆菌的荧光PCR检验方法。本部分适用于奶粉中阪崎肠杆菌的快速检验，其他食品可参照执行。2规范性引用文件下列文件中的条款通过SN/T1632本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。SN/T1632奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第1部分：分离与计数方法3定义、术语和缩略语下列术语、定义和缩略语适用于SN/T1632的本部分。3. 1阪崎肠杆菌 Enterobacter sakazaki肠杆菌科肠杆菌属革兰氏阴性无芽孢杆菌，周身鞭毛有动力，大多数产黄色素，具有α-葡萄糖苷酶活性。3. 2聚合酶链式反应 polymerase chain reaction聚合酶链式反应,简称 PCR。使用两段(20 个～24 个核苷酸)赛核苷酸作为反应的引物,这两段寡核苷酸引物的序列应不发生互补作用。但它们可以和称为模板的待测DNA两条链上的位点分别发生互补。反应液由包括含有镁离子的反应缓冲液、4 种单核苷酸(dNTP)、模板 DNA 及引物。在 DNA聚合酶催化下，通过温度的变化(DNA变性、退火及延伸)而合成两个互补位点之间的 DNA片断。这样的反应反复进行，使第个循环产生的DNA片段得以扩增。经 30左右个循环,扩增倍数达10°。3.3缩略语3. 3. 1 PCR:polymerase chain reaction,简称 PCR。3.3.2 DNA:deoxyribonuleic acid,脱氧核糖核酸。3.3.3dNTP:deoxyribonucleoside triphosphate,脱氧核苷酸三磷酸。3.3.4 dATP:deoxyadenosine triphosphate,脱氧腺苷三磷酸。3. 3.5 dCTP:deoxycytidine triphosphate,脱氧胞苷三磷酸。3.3.6 dGTP:deoxyguanosine triphosphate,脱氧鸟苷三磷酸。dTTP;deoxythymidine triphosphate,脱氧胸苷三磷酸。3.3.7dUTP:deoxyuridine triphosphate，脱氧鸟苷三磷酸。.9 UNG:uracil N-glycosylase,尿嘧啶 N-糖基化酶。Tris:tris(hydroxymethyl)aminomethane,三(羟甲基)氨基甲烷3. 3. 103.3.11Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。1 SN/T 1632.3—20054　测定方法4.1方法提要在普通PCR基础上，加入一条特异的寡核苷酸荧光探针。该探针5端标记了FAM荧光素，3端标记TAMRA荧光素，此时FAM的荧光被TAMRA淬灭，仪器检验不到其荧光信号；PCR延伸阶段，Taq DNA 聚合酶发挥其 5→3外切核酸酶功能,将探针切割，与此同时标记在探针上的 FAM 游离出来,其所发出的荧光不再为 TAMRA 所率灭而被仪器检验到。PCR 过程中,对目的片断进行一次有效的扩增,同时对探针进行了一次切割以及对 FAM 进行了一次检验。仪器检验到的 FAM 的增量,可以间接地反映目的片段的扩增量。奶粉经增菌后,取增菌液1 mL加到1.5mL无菌离心管中,8 000 r/min离心5 min，尽量吸弃上清液；加入50 μL DNA提取液（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），