SN_T 4881-2017鸡球虫病检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4881—2017鸡球虫病检疫技术规范Quarantine protocol for chicken coccidiosis2017-08-29 发布2018-04-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局#层查真 SN/T 4881--2017前 言本标准按照GB/T1.1-~2009给出的规则起草。本标由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江西出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国中山出人境检验检疫局、中华人民共和国无锡出入境检验检疫局。本标准主要起草人：杨春华、蔡先全、童明龙、孙思扬、孙洁、罗秋红、张强、祝建新、李仕祥、夏彪。Til SN/T 4881—2017鸡球虫病检疫技术规范1范围本标准规定了鸡球虫病的粪便检查、组织检查、聚合酶链式反应(PCR)的操作规程。本标准适用于鸡球虫病的检疫。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682　分析实验室用水规格和试验方法3 病原鸡球虫病是由艾美耳属(Eimeria)球虫寄生于鸡的肠上皮细胞内所引起的一种寄生性原虫病。简介参见附录 A。4设备、材料和试剂4.1设备电炉、显微镜、天平、离心机、移液器、冰箱（4℃、20℃）、水浴锅（或金属浴）、PCR仪、凝胶成像系统。4.2材料铜丝筛（60目）、尼龙筛（60目）、量筒、烧杯、接种环、研钵、平皿、吸管、载玻片、盖玻片、麦氏虫卵计数板。4.3试剂4.3.1实验室用水应符合GB/T 6682的规定。4.3.2饱和盐水称取 400g NaCl,放人烧杯中,加人1000 mL水，加热搅拌至全部溶解后，静置冷却，有少量盐析出，即为饱和盐水。4.3.3磷酸盐缓冲液将下列试剂依次加人到 1000 mL烧杯中：氯化钠8.00 g氯化钾0.20 g磷酸氢二钠1.44 g1 SN/T 4881--2017磷酸二氢钾0.24 g蒸馏水至 1 000 mL充分搅勾，调pH值至7.4，并定容至1000mL。103.41kPa压力下蒸气灭菌20min，室温保存，待用。%重铬酸钾溶液称取5g重铬酸钾固体，溶于200mL水中，搅拌至重铬酸钾完全溶解。4.3.5DNA提取试剂或成品试剂盒裂解缓冲液、0.5 mol/I EDTA、蛋白酶 K 溶液、核糖核酸酶溶液。4.3.6PCR 反应预混液4.3.7鸡球虫通用引物1)上游引物 P1:5-ACC TGG TTG ATC CTG CCA G-3下游引物 P2:5-CTT CCG CAG GTT CAC CTA CGG-34.3.8鸡球虫分型检测引物鸡球虫分型检测引物见表1。表 1鸡球虫分型检测引物种类引物名称引物序列5-3长度/bpAc-FCTGCGAGGGAACGCTTAAT堆型艾美耳球虫“303(E. acervulina)Ac-RAACGAACGCAATAACACACGBr-FCTGGGGCTGCAGCGACAGGG布氏艾美耳球虫183(E.brunetti)Br-RATCGATGGCCCCATCCCGCATMx-FTTGTGGGGCATATTGTTGTG巨型艾美耳球虫”151(E. marima)CAATGAGGCACCACATGTCTMx-RMt-FGTTTATTTCCTGTCGTCGTCTCGC和缓艾美耳球虫b330(E.mitis)Mt-RGTATGCAAGAGAGAATCGGGATTCCNe-FAGTATGGGCGTGAGCATGGAG毒害艾美耳球虫b160(E. necatrir)Ne-RGATCAGTCTCATCATAATTCTCGCG CATCGGAATGGCTTTTTGAAAGCGPr-F早熟艾美耳球虫b215(E.praecor)GCATGCGCTAACACCTCCCCTTPr-RTn-FCGCTGCTGGTTTTACAGGTT柔嫩艾美耳球虫463(E. tenella)Tn-RGCTGAAGCAAAGTTCCAAGCα参考文献[2]。参考文献[3]。通用引物为真核生物18SrDNAPCR通用引物，目的片段长度及序列信息参见附录B中B.1，引物序列引自参1)考文献[1]。2 SN/T 4881—20174.3.9电泳试剂TAE缓冲液、琼脂糖、电泳上样缓冲液、1 000 bp DNA 分子量标准。5 球虫诊断粪便检查2)采样量采集被检鸡只或鸡群的新鲜粪便不少于200g。5.1.2定性检查取新鲜粪便10g,放入50mL烧杯中，加人30ml.～40mI.水，搅匀。经60目铜丝网或尼龙网过滤。将滤液平均移人 4支 10 mL ～15 mL 试管,2 50