NY_T 2066-2011微生物肥料生产菌株的鉴别聚合酶链反应（PCR）法.pdf

ICS 65.080B 10NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2066—2011微生物肥料生产菌株的鉴别聚合酶链式反应(PCR)法Differentiation for strain of microbial fertilizer production by PCR method2011-09-01发布2011-12-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 2066—2011前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部种植业管理司提出并归口。本标准起草单位：农业部微生物肥料和食用菌菌种质量监督检验测试中心、中国农业科学院农业资源与农业区划研究所。本标准主要起草人：关大伟、曹凤明、杨小红、李俊、沈德龙、姜昕、冯瑞华、陈慧君、李力。I NY/T2066—2011微生物肥料生产菌株的鉴别聚合酶链式反应（PCR）法1范围本标准规定了PCR方法鉴别微生物肥料生产菌株的技术要求。本标准适用于微生物肥料生产菌株的鉴别。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T19495.3-2004转基因产品检测核酸提取纯化方法GB20287农用微生物菌剂NY/T1736微生物肥料菌种鉴定技术规范NY/T1847微生物肥料生产菌株质量评价通用技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1微生物肥料生产菌株strainformicrobialfertilizerproduction从自然界分离筛选或经人工诱变，具备微生物肥料功能，并可用于生产的菌株。以下将其简称为“菌株”。3.2鉴别differentiation确证菌株典型特征，判定该菌株是否为目标菌或具有某种功能基因片段的过程。3. 3多重PCRmultiplex-PCR在同一PCR反应体系中，利用两对以上的引物，可同时扩增多个基因片段。4原理DNA是生物体的遗传物质，携带所有的遗传信息，从DNA分子水平上进行鉴别是区分物种、品种甚至个体之间差异的最为有效的方法。本方法采用种属特异性引物或重复序列引物对待测菌株基因组DNA进行PCR扩增，使用电泳分离PCR产物，通过比较PCR产物的序列或大小及数量是否与预期相致，鉴别菌株是否为目标菌。5PCR反应要求5.1一般要求5.1.1实验室操作人员应具备良好的分子生物学专业技能，操作熟练。1 NY/T2066—20115.1.2有毒、有害、废弃物质的处理及安全防护应符合GB/T19495.2的要求。5.2PCR反应的质量控制5.2.1每个PCR反应均应设立两个平行实验。5.2.2应设置空白对照、阳性对照和阴性对照，空白对照的PCR反应体系中以水代替DNA模板，阳性对照使用与目标菌株同种的模式菌株或参比菌株的DNA为模板，阴性对照采用不含目标序列的DNA为模板。5.3引物5.3.1基本要求每个引物长度为18个～30个核苷酸；两引物之间不应互补，尤其是3末端不存在互补性；引物自身不形成二级结构；引物的GC含量为40%60%。5.3.2菌株鉴别的引物设计要求引物设计的靶标DNA(基因)片段用于属、种水平的鉴别基因有16SrRNA、23SrRNA和18SrRNA等；用于种、亚种水平的鉴别DNA片段有16S23SrRNA间隔序列、26SrRNA中D/D2区域、18S~28SrRNA间隔序列、rpoA、rpoB和gyrB基因等；一用于菌株水平的鉴别DNA片段有ERIC、BOX和REP等重复序列：-用于菌株功能鉴别的基因片段，依据NY/T1847的菌株功能分类进行其引物的设计。设计的引物应和GenBank、EMBL等核酸序列数据库中的标准菌株DNA序列作同源性比对，评价是否与近缘菌种具有同源序列。根据鉴别对象与需要，可选择二对以上的引物，并做同源比较。依据设计合成引物序列，对其进行鉴别能力与范围的评价实验，以确认其适用性。用于微生物肥料常用菌株种水平鉴别的靶基因和引物序列见附录A，菌株水平鉴别的靶基因和引物序列见附录B。5.4模板DNA提取及其浓度测定5.4.1DNA提取方法参见附录C。5.4.2DNA浓度测定按照GB/T19495.3的规定执行。5.5扩增反应5.5.1优化PCR反应条件，特别是镁离子浓度和热循环条件。5.5.2对多重PCR反应，应适当增大模板DNA、引物、聚合酶和dNTP用量，且在各引物解链温度Tm允许范围内选择较高的退火温度。5.5.3反应参数见附录A和附录B。5.6PCR产物的确证5.6.1以ERIC-PCR、BOX-PCR和REP-PCR等方法对菌株水平鉴别时，应与其阳性对照PCR产物电泳图谱带型进行比较。使用除5