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SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3730.7-2013食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第7部分：水牛成分检测实时荧光PCR法Identification of domestic animal ingredient in food and feed-Part 7 : Detection of buffalo ingredient-Real-time PCR method2014-06-01实施2013~11-06 发布中华人民共和国发布D国家质量监督检验检疫总局站t SN/T 3730.7—2013前創言SN/T3730《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法》共分为以下8个部分：-第1部分：貂成分检测　实时荧光PCR法；-第2部分：狗成分检测实时荧光 PCR法;一一第3部分：狐狸成分检测实时荧光PCR法；第4部分：驴成分检测实时荧光 PCR法；第5部分：马成分检测实时荧光PCR法；--第 6部分:猫成分检测实时荧光PCR法；第7部分：水牛成分检测实时荧光PCR法；第8部分：猪成分检测实时荧光PCR法0本部分为SN/T 3730的第7部分。本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、广西水牛研究所。本部分主要起草人：张舒亚、曾庆坤、王赢、袁辰刚、李富威、林波、李想、陈颖、韩建勋。 SN/T 3730.7—2013食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第7部分：水牛成分检测实时荧光 PCR 法范围SN/T3730的本部分规定了食品和饲料中水牛成分的实时荧光-PCR检测方法。本部分适用于食品和饲料中水牛成分的定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件3.1实时荧光 PCR real time PCR在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。3.2Ct 值cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonuleic acid)dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate)CTAB:十六烷基三甲基漠溴化铵（cetyltrithylammonium bromide)Tris:三(羟甲基)氨基甲烷Ltris（hydroxymethyl）aminomethane]EDTA:乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid)Taq:水生栖热菌(Thermus aquaticu)OD:光密度值(optical density)5　方法提要样品经研磨后，提取DNA，以DNA为模板，采用水牛的特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR1 SN/T 3730.7--2013扩增，观察实时荧光PCR的增幅现象，判断样品中是否存在水牛成分。6试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。6.1检测用引物和探针：见表1。表1引物和探针名称序列(5′--3)具的基因TTCATTGA YCTCCCTGCTCC水牛成分5端引物GGAATAGGCCGGTGAGGATT水牛线粒体ATPase8基因水牛成分3”端引物水牛成分探针FAM-ACTTTGGCTCTCTCC-MGB6.2 十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammonium bromide,CTAB)。6.3三羟甲基氨基甲烷［tris(hydroxymethyl)aminomethane,Tris]。6.4 乙二胺四乙酸二钠(disodium ethylenediaminc tetraacetic acid,Na,EDTA)。6.5氯化钠（NaCl)。6.6三氯甲烷(氯仿)。6.7 异丙醇。6.8无水乙醇。6.9 70%乙醇。6.10CTAB 提取缓冲液:20 g/L CTAB,1.4 mol/L NaCl.0.1 moi/I Tris-HCl,0.02 mol/LNa2 EDTA,pH1CTAB沉淀液:5 g/L CTAB,40 mmol/L NaCl。6.12蛋白酶 K溶液（20 mg/mIL）。6.13 NaCl 溶