SNT 1907-2007副结核分枝杆菌PCR检测技术操作规程.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1907-—2007副结核分枝杆菌PCR检测技术操作规程Protocol of the PCR for mycobacterium paratuberculosis2007-05-23 发布2007-12-01实施1.0.中华人民共和国余层发1015整查诗真发布数码防伪究国家质量监督检验检疫总局 1！中华人民共和国出人境检验检疫1行业标准副结核分枝杆菌PCR检测技术1操作规程: -SN/T 1907-—2007!中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045网址 www. . cn电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16　印张0.5　字数 7千字反　2007年9月第一次印刷2007年9月第一版印数 1一-2 000*定价6.00元书号：155066·2-18051 1SN/T 1907-2007...言前 1本标准的附录 A和附录B均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山西出人境检验检疫局。本标准主要起草人：巩红霞、廉慧锋、连庚寅、巩强、吴海军、雷雨平、李卫华、张祖维。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。11一11一一 SN/T 1907-2007副结核分枝杆菌PCR检测技术操作规程1!1 范围本标准规定了副结核分枝杆菌PCR检测方法。本标准适用于牛、羊等反台动物的粪便及奶中副结核分枝杆菌的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究!是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（eqVISO3696:1987)！3试剂和材料3.1主要仪器3.1.1PCR热循环仪3.1.2 天平。3.1.3超净工作台。3.1.4消毒灭菌锅。3.1.5高速冷冻离心机。3.1.6低温冰箱,冷藏冷冻冰箱。3.1.7实验用水制备装置。3.1.8高温干燥箱。旋涡振荡器。.10凝胶成像分析系统。3. 1.11恒温水浴振荡器。3.1.12磁力搅拌器。3.1.13微量移液器。3.2主要试剂3.2.1除另有规定外，所有试剂均采用分析纯或生化试剂。3.2.2实验用水：应符合GB/T 6682中一级水的规格。所用试剂配方参见附录A。4检测步骤4.1样品的制备4.1.1标准菌株：副结核分枝杆菌由国家质检总局指定单位提供。4.1.2粪便：称取新鲜粪便1g，加3mLPBS（pH7.4参见第A.5章），混匀，放置30min或300r/min室温离心5min，取上清液，室温放置30min或300r/min室温再次离心5min，取上清液，12000r/min室温离心15 min,弃上清液，加人400 μL TE。4.1.3奶样：无菌操作取1mL奶加 10 μLTriton X-100,混匀，12000 r/min室温离心15 min,弃上清 SN/T 1907--2007液，管壁残留的奶样用灭菌的棉签擦掉,加人 400μIL TE。4.2　DNA模板的提取4.2.180℃水浴加热 20 min,冷至室温。4.2.2加50μL溶菌酶（参见第A.2章）,37℃气浴振荡培养1h。4.2.3加75ul.SDS/蛋白酶K（参见第A.3章），混匀，65℃水浴加热10min。4.2.4　加100μI.5mol/LNaCl和100μL65℃预热5min的CTAB/NaCl(参见第A.4章），上下颠倒混匀，直至液体变为白色（奶状），65℃水浴加热10min。4.2.5加750μL三氯甲烷：异戊醇（24：1），混匀，12000r/min室温离心5min。4.2.6取上层水相于新管,加等体积的三氯甲烷：异戊醇(24：1）,混匀，12000r/min室温离心5min。4.2.7取上层水相于新管，小心加人0.6体积的异丙醇沉淀核酸，小心手摇混匀，一20℃放置30min，12 000 r/min 室温离心15 min。4.2.8弃上清液，加人500μl.预冷的70%的乙醇，12.000.r/min室温离中5min，弃上清液。4.2.9小心吸走液体，室温下干燥10min左右,用50μLTE(参见第A1章)溶解，4℃保存。4.3 PCR 法4.3.1引物：来源于美国农业部：正向引物:Primer90:5′-GTTCGGGGCCGTCGCTTAGG-3反向引物:Primer91:5-GAGGTCGATCGCCCACGTGA-3?扩增副结核分枝杆菌基因中的400bpDNA带.循环条件:93℃变性1min，58