SN 1400-2004甘蔗流胶病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1400--2004甘蔗流胶病菌检疫鉴定方法Methods for the quarantine and identification of Xanthomonas axonopodis py.vasculorum(Cobb 1894)Vauterin,Hoste, Kerster Swings06-01 发布2004-12-01实施中华人民共和国发布155.证国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 1400—2004前言本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广西出人境检验检疫局。本标准主要起草人：张君潮、黄胜光、叶盛华、文新。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 SN/T 1400—2004甘蔗流胶病菌检疫鉴定方法1范围了本标准规定了进境植物检疫中甘蔗流病菌的检疫和鉴定方法。本标准适用于进境甘蔗蔗茎、甘蔗叶片中甘蔗流胶病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T4789.28—1994食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3原理甘蔗流胶病菌属于原核生物总界细菌界（Procaryotes），薄壁细菌门（Gracilicutes），假单胞杆菌科（Pseudomonadaceae），黄单胞杆菌属（Xanthomonas），地毯草流胶病黄单胞菌维管束致病变种（Xaxonopodis pv.vasculorum),可侵染甘蔗的叶片和蔗茎,形成条斑和流胶症状。该菌引起的甘蔗流胶病有明显的症状,病原菌有独特培养性状和生理生化特征。病害的症状、病原菌的形态、病原菌的培养、生理生化性状以及致病性测定是鉴定甘蔗流胶病菌的依据。4仪器和用具4.1仪器生物显微镜、生物培养箱等。4.2用具高压灭菌器、普通天平、超净工作台、酒精灯、培养皿、试管、载玻片、盖玻片、接种针或缝纫针、接种环、移液器、小刀、剪刀、镊子、玻璃棒等。5 培养基和试剂5.1YPGA培养基配方:酵母膏 5g/L,葡萄糖 20 g/L,蛋白陈 10 g/L,琼脂15g/L,pH7.2。5.2YDC培养基配方：酵母膏10g/L,D-葡萄糖20g/L,碳酸钙20g/L,琼脂15g/L,pH7.2。5.3GYCA培养基配方:酵母膏5g/L,葡萄糖 5g/L,碳酸钙 40g/L,琼脂15g/L。5.4明胶、升汞液（氯化汞12g,蒸馏水80mL,浓盐酸16mL）。5.5 磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸钠、硝酸钠。5.6蛋白陈、磷酸氢二钾、七叶苷、柠檬酸铁。5.7牛肉浸膏、氯化钠、琼脂、可溶性淀粉。5.8产酸产气及利用碳源、氮源试验用试剂：木糖、阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖、纤维二糖、甘油、麦芽糖、鼠李糖、菊粉、水杨苷、甘露醇、山犁醇、半乳糖醇、阿东糖醇、α-甲基-D-葡萄糖苷溶液，乙酸盐、丙酸盐、柠檬酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、苯甲酸盐、草酸盐、酒石酸盐、葡萄糖酸盐，天冬酰胺。1 SN/T 1400--20045.9 灭菌水。6现场检疫在现场检疫时，应仔细检查蔗茎、蔗叶有无病变症状，如发现黄色至白色纵条纹且在叶尖处较多的叶片，或切口有黄色至橙色的胶状团块、蔗节上维管束变红色的蔗茎等流胶病可疑症状时，应取样作实验室鉴定。在产地检疫和隔离试种期间，还要注意检查有无生长矮小或生长点死亡的植株，当发现可疑症状应取样作实验室鉴定。7 实验室鉴定7.1病原菌分离纯化7.1.1分离纯化发现菌脓的蔗茎或蔗叶，直接在无菌操作条件下将菌脓用无菌水制成分离用悬液，用YPGA培养基加胆盐进行稀释分离，置培养箱内27℃～28℃条件培养3d～7d。然后再进行-次至二次的纯化,最后获得纯菌株。7.1.2保湿培养将怀疑有症状而没有菌脓流出的蔗茎砍断,栽植于湿透细砂中，或将怀疑有症状的叶片切断，置于湿润的容器中。置于 27℃～28℃条件下培养 4 d～6 d,在横切面上见到流出菌脓后用 7.1.1方法获得纯菌株。7.2病原菌形态观察及生理生化测定7.2.1形态观察对分离纯化获得的纯菌株，经染色制成玻片，在显微镜下观察形状，测量大小。7.2.2菌落颜色和粘液的形成待测菌在GYCA或 YDC培养基上划线培养,置培养箱内27℃～28℃条件下培养 3d～7d,观察菌落的颜色和粘液的形成。7.2.3鞭毛染色法按GB/T4789.28—1994中2.7规定的方法进行7.2.4革兰氏染色法按GB/T4789.28—1994中2.2规定的方法进行。7.2.5明胶液化