SN_T 2344-2014黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2344—2014代替SN/T 2344—2009黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法Detection and identification of cucumber green mottle mosaic virus2015-05-01实施2014-11-19 发布中华人民共和国发布拉国家质量监督检验检疫总局1060刮涂层查真伪 SN/T 2344-2014前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准代替了SN/T2344一2009《黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法》。本标准与SN/T2344-2009相比，主要技术变化如下：增加了“实时荧光定量RT-PCR方法”和“快速免疫层析检测”。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局。本标准主要起草人：陈青、梁新苗、黄峰、廖富荣、陈细红、陈红运、林石明。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T 234420091 SN/T 2344—2014黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法1范围本标准规定了黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定的免疫学和分子生物学检测方法。本标准适用于可能带有黄瓜绿斑驳花叶病毒的植物的种子、苗木及植物产品的检疫鉴定。2黄瓜绿斑驳花叶病毒基本信息学名:cucumber grecn mottle mosaic virus缩写:CGMMV分类地位：烟草花叶病毒属（Tobamouirus）的成员CGMMV通过机械传播，也通过种子传播。嫁接等农事操作是田间病害流行的主要因素之一，CGMMV还可以经 Cuscuta subinclusa，啤酒花丝子（C.lupuliformis）和 C.campestris 传毒，植株一旦发病，如果未进行杀灭处理，土壤也可带毒，带毒土壤也可成为病害发生的侵染源详细资料参见附录A。3　方法原理根据黄瓜绿斑驳花叶病毒与抗体之间的特异性反应，对瓜类叶片或种子进行 ELISA 检测；根据该病毒基因组特性进行PCR特异性检测，通过电泳条带大小进行结果判定。4仪器设备与试剂4.1仪器设备和用具微量研磨仪、酶标仪、洗板机、微量天平（感量：0.001g）、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽、pH计、移液器（1000 μI、200 μI、20 μI、2μL）、96孔酶标板、研钵等;防虫温室。4.2试剂试剂和缓冲液见附录 B、附录 C、附录 D、附录 E,参见附录 F、附录 G。5检测样品的制备5.1种子样品制备挑取畸形、不成熟种子播于灭菌土中，待长出3～4片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号，采集的叶片分成2份，根据需要分别用于后续的试验也可以挑取畸形、不成熟的种子直接进行酶联测定和分子生物学检测。1 SN/T 2344—20145.2　苗木有症状（如：叶片畸形、花叶、斑驳等）的苗木编号单独检测。没有症状的分组并编号检测，分组方法和检测方法同5.1。5.3植物产品植物产品有症状的部分（如：叶片畸形、花叶、斑驳等)单独编号检测。没有症状或无法观察症状的植物产品·应按比例取样，分组编号，分组方法和检测方法周5.1。6检测与鉴定6.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)把制备的样品上清液加人已包被CGMMV抗体的96孔酶联板中.进行DAS-EILISA检测。每个样品平行加到两个孔中。设阴性对照和阳性对照（健康的植物组织作阴性对照，感染了CGMMV的植物组织作阳性对照），样品提取缓冲液作空白对照，其中阴性对照种类和材料（如种子或叶片）应尽量与检测样品一致。不同的检测试剂或试剂盒根据试剂或试剂盒的说明操作。具体操作见附录B。6.2RT-PCR 检测分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。健康的植物组织作阴性对照·感染CGMMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。具体操作见附录C。6.3实时荧光定量 RT-PCR检测分别提取样品和对照的总RNA，进行实时荧光定量RT-PCR实验。健康的植物组织作阴性对照。感染CGMMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。具体操作见附录D。6.4快速免疫层析检测取待检测叶片按1：10（质量：体积)加人PBS缓冲液，匀浆，离心，将黄瓜绿斑驳花叶病毒免疫层析试纸条有箭头的一端插人样品溶液中，观察。具体操作见附录E。6.5免疫电子显微镜观察具体操作参见附录F。6.6生物学接种检测具体操作参见附录G。7结果判定如果其中2种方法检测结果为阳性，即可判断该批样品携带黄瓜绿斑驳花叶病毒。一般是酶联测定为阳性后.RT-PCR检测为阳性即可判断为样品携带黄瓜绿斑驳花叶病毒。8结果记录与样品保存8.1结果记录