SN_T 2618-2010桉树溃疡病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2618—2010按树溃疡病菌检疫鉴定方法Inspection and identification of Cryphonectria cubensis (Bruner)Hodges2010-05-27发布2010-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局微码防构 SN/T 2618—2010言前本标推按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：严进、常雪艳、张秋娥。- SN/T 2618—2010按树溃疡病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了植物检疫中桉树溃疡病菌Cryphonectriacubensis（Bruner）Hodges的检疫鉴定方法。本标准适用于对来自疫区（参见附录A第A.1章）的所有桉属[Eucalyptus]和桉树溃疡病菌其他寄主的原木、木制品（含木质包装）和苗木的检疫鉴定。2原理引起桉树溃疡病的病原为古巴隐丛赤壳Cryphonectriacubensis（参见附录A第A.2章），该菌的寄主范围（参见附录A第A.3章）、植株症状（参见附录A第A.4章）、侵染传播（参见附录A第A.5章）和病原形态（参见附录A第A.6章）是该菌检疫鉴定方法的依据。与Cryphonectria spp.形态特征的区别主要依赖于子座的区别。子座特征可以将按树溃疡病菌同Cryphonectria的模式种C.gyrosa(Berk. Broome)Sacc.以及该属其他种如 C. parasitica、C.radicalis、C. macrospora 和 C. nitschkei区分开。按树溃疡病菌与桉树上其他3种病原真菌的形态比较参见附录A第A.7章。3试剂及主要仪器设备3.1培养基及试剂麦芽提取粉琼脂培养基（MaltExtractAgar，MEA，20g/L，Biolab公司）、燕麦琼脂培养基（OatmealAgar，OA：燕麦粉30g，蒸馏水800L，溶化成汁加人20g/LBiolab公司琼脂中）、25%乳酸、1.25%次氮酸钠（NaC1O)、无菌水、75%酒精。3.2仪器与设备立体显微镜、生物显微镜（具油镜和测微尺）、电子分析天平（感量0.001g）、普通天平（感量0.1g）、超净工作台、生物培养箱、高压灭菌器。4检疫与鉴定4.1症状检查检查树皮和木质部之间是否有溃疡层和黑色的圆锥状分生孢子器。将抽取的原木、木制品或苗木用斧子或锯子分别横向和纵向切开，仔细观察横断面有无暗褐色扇形溃疡斑（参见附录A第A.4章）。将有症状样品带回实验室作进一步检验。4.2室内检验4.2.1样本形态鉴定观察并记录子实体（尤其是子座）的形态特征，从树皮上采集子实体，然后在水中煮沸1min，以再 SN/T 2618—2010水化细胞，切成12um截面，置于乳酚或者3%氢氧化钾中染色，观察并记录分生孢子或者子囊等部分的形态。共测量50个子囊孢子、子囊、分生孢子和产孢细胞的大小。至少分别计算10个无性阶段和10个有性阶段子座的测距。拍摄并保存数码照片。4.2.2分离培养如果无法直接采集到病原菌的子实体，则采用MEA（20g/L)培养基，用于病原菌的分离、培养性状测定，菌种保存在OA培养基。在可疑发病的暗褐色溃疡处取一块组织，切成4mm×4mm的小片，用1.25%次氮酸钠表面消毒5min，无菌水冲洗3遍，放在直径9cm的平板培养基上，每皿放4片～6片，于30℃培养箱内培养，黑暗和光照各12h交替。待菌落出现，镜检并记录培养基上生长菌落的形态特征，计算菌落的生长速度。如菌落菌丝和分生孢子的形态特征与-Gcuhensis相似，继续培养观察平板培养基上是否产生子囊壳等。有文献报道认为，按树溃疡病菌在培养基上培养时，很少形成孢子，特别是接种后，不产生有性型。4.3鉴定标准4.3.1营养体形态在MEA上菌落为白色，带肉桂至淡褐斑点娥毛状，边缘平滑，生长速度快，在30℃下盖90mm直径平板最少5d。4.3.2无性繁殖器官形态分生孢子器，表生，暗褐至黑色，梨形至球形，颈部渐狭参见图A，2a)。分生孢子器的基部高出树皮表面130μm~740μm，直径100μm~95@μm，颈部长230μm，宽90μm~240μm。分生孢子梗[参见19.0(24/5）μum。分生孢无[参见图A.2d)透明，单细胞，卵图A.2b）～c)透明，总长（12)13.5m~形,[3. 5 μm~4. 0(4. 5)μm]×(1.,6YT4.3.3有性繁殖器官形态子囊果[参见图A.2e)半埋生于树皮中，暗褐至黑色，有时微爆裂，有限生长。子囊座组织橙色，子每个存座1囊座高出树皮120μm~230um，直径288490 μth。～9个子囊壳