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PCR 原理和步骤 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增 DNA 或 RNA 的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA 片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃ 左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在 Taq DNA 聚合酶合成 DNA 的最适温度下, 以目的 DNA 为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的 DNA 扩增一倍 （图4）,这些经合成产生的DNA 又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35 轮循环就可使DNA 扩增达106 倍。一、 PCR 反应中的主要成份 引物：PCR 反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是 PCR 成败的关键。引物设计和选择目的 DNA 序列区域时可遵循下列原则：(1) 引物长度约为 16-30bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。(2) 引物中 G+C 含量通常为 40%-60%, 可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm＝4(G+C)+2(A+T).(3) 四种碱基应随机分布，在 3端不存在连续 3 个 G 或 C,因这样易导致错误引发。(4) 引物 3端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应, 以减少由于密码子摆动产生的不配对。(5) 在引物内, 尤其在 3端应不存在二级结构。(6) 两引物之间尤其在3端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少产量。两引物间最好不存在 4 个连续碱基的同源性或互补性。(7) 引物 5端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在 5端限制酶位点外再加 1-2 个保护碱基。(8) 引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构, 以免产生非特异性扩增,影响产量。 (9) 简并引物应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的 Met, 3端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。 一般 PCR 反应中的引物终浓度为 0.2-1.0μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。利用紫外分光光度计, 可精确计算引物浓度, 在 1cm 光程比色杯中,260nm 下,引物浓度可按下式计算： X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600) X: 引物摩尔浓度,A、C、G、T: 引物中 4 种不同碱基个数。 4 种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：dNTP 应用 NaOH 将 pH 调至 7.0,并用分光光度计测定其准确浓度.dNTP原液可配成 5-10mmol/L 并分装,-20℃贮存。一般反应中每种 dNTP 的终浓度为 20-200μmol/L。理论上 4 种dNTP 各20μmol/L,足以在100μl 反应中合成2.6μg 的DNA。当dNTP 终浓度大于50mmol/L 时可抑制Taq DNA 聚合酶的活性.4 种 dNTP 的浓度应该相等,以减少合成中由于某种 dNTP 的不足出现的错误掺入。 Mg2+：Mg2+浓度对 Taq DNA 聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影响引物退火和解链温度, 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常 Mg2+ 浓度范围为 0.5-2mmol/L.对于一种新的 PCR 反应, 可以用 0.1-5mmol/L 的递增浓度的 Mg2+ 进行预备实验,选出最适的 Mg2+浓度。在 PCR 反应混合物中, 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团, 例如磷酸基团或 EDTA 等可能影响 Mg2+ 离子浓度的物质,以保证最适Mg2+ 浓度。 模板：PCR 反应必须以 DNA 为模板进行扩增, 模板 DNA 可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好).就模板 DNA 而言,影响 PCR 的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为 102 -105 个拷贝,对于单拷贝基因,这需要 0.1μg 的人基因组DNA,10ng 的酵母 DNA,1ng 的大肠杆菌 DNA.扩增多拷贝序列时,用量更少.灵敏的 PCR 可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的 DNA 中分析目的序列.模板量过多则可能增加非特异性产物.DNA 中的杂质也会影响 PCR 的效率。 Taq DNA 聚合酶：一般 Taq DNA 聚合酶活性半衰期为 92.5℃ 130min,95