SN_T 2710-2010山羊传染性胸膜肺炎检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2710—2010山羊传染性胸膜肺炎检疫技术规范Quarantine protocol for contagious caprine pleuropneumonia2011-05-01实施2010-11-01发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 2710—2010前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准修改采用《陆生动物诊断试验与疫苗手册》（2009版）第2.7.6章。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：郑小龙、梁成珠、朱来华、孙敏、徐彪、邓明俊、岳志芹、肖西志。I SN/T2710—2010山羊传染性胸膜肺炎检疫技术规范1范围本标准规定了山羊传染性胸膜肺炎的病原分离与鉴定、微量间接血凝试验、补体结合试验和聚合酶链式反应（PCR)技术。本标准适用于山羊传染性胸膜肺炎的诊断和检疫2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T4789.28—2003食品微生物学检验染色法，培养基和试剂3临床诊断3.1临床症状山羊传染性胸膜肺炎的典型特征是极度高热（41℃43℃），发病率和死亡率很高，妊娠山羊易流产。在高热约2d～3d后，出现明显的呼吸症状：呼吸加速，状态痛苦偶尔出现呼噜声，持续性地剧烈前腿分开站立，颈项僵硬前伸有时候嘴里不断地流出涎液。咳嗽。在病程后期山羊失去运动能力3.2判定根据临床症状可以作出初步判定。如要确诊需送实验室做进一步检查。4病原分离鉴定4.1设备和器材生化培养箱、显微镜、无菌棉拭子、载玻片、灭菌平血、灭菌试管和试管架、酒精灯。4.2培养基和试剂10%马血清马丁肉汤、10%马血清马丁琼脂，见附录A。生化用培养基：按GB/T4789.28一2003中第3章的规定。4.3样品的采集与处理4.3.1用无菌棉拭子采集患病动物鼻腔分泌物，移人含抗生素（青霉素100U/mL和链霉素100μg/mL)的灭菌生理盐水中；或用注射器无菌穿刺采取胸腔液。4.3.2无菌采集死亡动物的胸水和纵隔淋巴结，以及肺病变部的病料，特别是硬变部位和非硬变部位交界处的样品。4.3.3采集样品应尽快低温（0℃～4℃)运往实验室，如无法立即送往实验室，应将样品置于一20℃冷冻保存。1 SN/T 2710—20104.4病原分离培养在无菌条件下剪碎病料，用无菌接种环钩取样品接种于10%马血清马丁肉汤内；鼻腔拭子浸出液和胸腔液用灭菌吸管吸取0.1mL～0.3mL接种于10%马血清马丁肉汤，接种后置37℃培养。同时取上述病料在10%马血清马丁琼脂平板上划线接种，平板用胶布封口，置37℃5%二氧化碳培养箱中培养。每天检查肉汤培养物生长情况即颜色变化和有无絮状物出现。肉眼观察出现混浊时，表示有细菌污染，应将培养物经孔径0.45um的滤膜过滤后再移植，用1/10的量接种于肉汤培养基或用接种环钩取培养物在琼脂平板上划线培养。在平板上培养14d，每1d～3d用解剖镜（放大5倍～50倍）配以透射和人射光源检查一次；继代时切下带有孤立菌落的琼脂块，表面朝下，在新鲜琼脂平板表面上并稍推动，或将其投入新鲜肉汤培养基内。也可用巴氏吸管将带有单个菌落的琼脂块吸出，在新鲜肉汤培养基中培养，作初次分离用的肉汤培养基接种后培养7d，如果仍不见生长迹象，要进行盲传。每份样品的培养物，包括一次盲传继代至少检查3周后，方可废弃。4.5结果判定4.5.1培养特征在低次代中，固体培养基上可产生畸形菌落，小型、无芯、形状不规则。经过传代，形成圆形、露滴状的小菌落，直径1mm～3mm，大小不一；在40倍显微镜下可看见典型的煎蛋样菌落，部分有脐眼。挑取典型菌落或取肉汤培养物涂片，用瑞氏染色法进行染色，显微镜下可看到大小不一、形态多样的紫色小点，有圆形、逗点形、棒形、环形和不规则形等，但以圆形居多。4.5.2生化特征分别接种各类生化反应培养基，具体的生化反应内容见表1。表1生化反应特征项I生化特性项目生化特性+±膜斑形成发酵葡萄糖+液化血清水解精氨酸-分解尿素吸附鸡红细胞十+溶血素测定还原美蓝注：十：阳性一：阴性。5微量间接血凝试验5.1仪器设备分析天平、离心机、V型血凝板、微量振荡器、50uL可调移液器、恒温箱等。5.2试剂和材料标准抗原、标准阳性血清和标准阴性血清、磷酸盐缓冲液（PBSpH7.2）、阿氏液（试剂配制见附录A)，1%致敏绵羊红细胞（见附录B)。2 SN/T2710—20105.3操作方法5.3.1街微量间接血凝试验操作术式见表2。在V型微量血凝板上，每孔加PBS25μL。表2微量间接血