SNT 1129-2007牛病毒性腹泻/粘膜病检疫规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1129—2007代替 SN/T 1129.1～1129.2—2002牛病毒性腹泻/粘膜病检疫规范Quarantine protocol for bovine viral diarrhea/mucosal disease2008-03-01实施2007-08-06 发布中华人民共和国技发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 1129—2007前言本标准代替SN/T1129.1一2002《牛病毒性腹泻/粘膜病病毒微量血清中和试验操作规程》和SN/T1129.2一2002《牛病毒性腹泻/粘膜病病毒分离操作规程》。本标准的附录 A和附录 B均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本标准主要起草人：孙颖杰、张伯强、白泉阳、张体银、袁文泽、简中友、董志珍、霍蕾。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T 1129.1--2002;-SN/T 1129.2-—2002。 SN/T 1129—2007牛病毒性腹泻/粘膜病检疫规范1范围本标准规定了牛病毒性腹泻检疫规范。本标准适用于牛病毒性腹泻的病毒分离鉴定、病毒抗原检测、病毒抗体检测，可用于该病的检疫、诊断和流行病学调查。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3疾病概述牛病毒性腹泻（bovine viral diarrhea,BVD)是由牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的一种以腹泻为临床特征的传染病，可导致怀孕母牛的流产、死胎、致畸或新生犊牛的持续感染,它具有高度传染性，但症状和病变较轻，发病率高而死亡率低。粘膜病(Mucosal Disease,MD)也是由 BVDV 引起的一种以牛的急性型口腔、消化道粘膜发炎、糜烂、溃疡为特征的传染病。它和牛病毒性腹泻是同一病原引起，但表现不同的临床症状，发病动物口腔，特别是沿齿龈边沿糜烂，还可出现流泪和大量流涎。该病传染性不高,临床症状明显，发病率低,而死亡率很高。其病原、流行病学、症状、发病机理和病理变化、检疫及诊断参见附录 A。4检疫方法4.1 病毒分离和鉴定4.1.1仪器试剂倒置荧光显微镜。4. 1. 1.2二氧化碳培养箱。4.1. 1.3310 mL标准细胞培养瓶，24孔平底细胞培养板，带盖湿盒。无BVD抗体胎牛血清,细胞分散液。BVD标准毒株(OregonC24或 NADL)和标准阳性血清,BVD荧光抗体,BVD 酶标抗体。细胞:使用 MDBK 细胞或三代以内未感染 BVD 病毒的胎牛肾细胞(BK)。溶液及细胞培养液：配制参见附录B。4.1.2样品的采集对于牛群、种牛的检疫,应无菌采集血液或者精液。对于怀疑为死于病毒性腹泻的牛,应采集血凝块和肠系膜淋巴结。对于流产、死胎牛的检疫，应采集胎儿的组织。4.1.3样品的处理血液用常规方法分离血清，血凝块应冻融3次后,取析出的上清液。精液冻融3次（或超声波裂解)后，按规定稀释，离心取上清液。动物组织加10倍体积含有1000IU/mL双抗的细胞培养液研磨，离心取上清液。1 SN/T 1129--20074.1.4样品的培养取生长良好，形成80%以上单层的MDBK细胞，倒去培养液，接种处理好的样品，每瓶接种1 mL，每个样品接种3个细胞瓶，同时直接接种样品稀释液作为阴性对照。置37℃二氧化碳培养箱吸附30 min～60 min。倒去样品，加入维持液,37℃二氧化碳培养箱培养6d。收获病毒，同一样品3瓶混合,放至一20℃冻融3次后进行下一步鉴定。4.1.5荧光抗体法鉴定将生长良好的细胞，用细胞分散液处理后，制备成2×105个/mL的细胞悬液,加人24孔细胞培养板内，每孔0.8mL，置37℃培养。待细胞生长成80%的单层，吸出孔内培养液，接种样品培养物，每孔 400μL，每个样品4个孔。阴性、阳性和空白细胞对照苏法同待检样品培养物。置37℃二氧化碳培养箱吸附30min～60min。吸出各孔内所加的待脸和对照样品，加入维持液，每孔0.8mL，置37℃二氧化碳培养箱培养3 d.弃掉24孔培养板内的培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS)漂洗自然干燥后，用一20℃丙酮固定15 min，用PBS洗3次，自然干燥。取固定好的24孔培养板,每个待检样品及阴性、阳性和空白细胞对照孔分别加人BVD阳性血