SN_T 2754.8-2011出口食品中致病菌环介导恒温扩增（LAMP）检测方法 第8部分：肺炎克雷伯氏菌.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2754.8—2011出口食品中致病菌环介导恒温扩增（LAMP)检测方法第8部分：肺炎克雷伯氏菌Loop-mediated isothermal amplification detection method for pathogensin export food-Part 8 :Klebsiella pneumoniae2011-02-25发布2011-07-01实施中华人民共和国发布0国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 2754.8—2011前言SN/T2754《出口食品中致病菌环介导恒温扩增（LAMP)检测方法》共分为15个部分：第1部分：金黄色葡萄球菌；第2部分：大肠杆菌0157；第3部分：志贺氏菌；第4部分：单核细胞增生李斯特菌；-第5部分：副溶血性弧菌；第6部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌；第7部分：空肠弯曲菌；第8部分：肺炎克雷伯氏菌；-第9部分：溶血性链球菌；第10部分：产气荚膜梭菌；-第11部分：产霍乱毒素的霍乱弧菌；-第12部分：溶藻弧菌；第13部分：创伤孤菌；-第14部分：假结核耶尔森氏菌；-第15部分：阪崎肠杆菌。本部分为SN/T2754的第8部分。本部分按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、广州华峰生物科技有限公司、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫局、湖北出人境检验检疫局检验检疫技术中心、中华人民共和国重庆出人境检验检疫局。本部分主要起草人：易敏英、王志强、高东微、李志勇、李晓虹、曹以诚、雷质文、凌莉、阳静、胡科锋、陈碧玲、郑文杰、刘津、郑晶、高旗利、陈洵、谢力、曾宪东、张霞、谭志、张体银。 SN/T 2754.8--2011出口食品中致病菌环介导恒温扩增(LAMP)检测方法第8部分：肺炎克雷伯氏菌1范围SN/T 2754的本部分规定了检测出口食品中肺炎克雷伯氏菌的环介导恒温核酸扩增(LAMP)法。本部分适用于出口食品中肺炎克雷伯氏菌的筛选检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14926.13实验动物肺炎克雷伯杆菌检测方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测肺炎克雷伯氏菌，所有培养物和废弃物应按照GB19489中的有关规定执行。4防污染措施防止污染措施应符合GB/T27403的规定，5缩略语下列缩略语适用于本文件。Betaine:甜菜碱Bst 酶[Bst DNA polymerase(large fragment)]:Bst DNA 聚合酶(大片段)DNA(deoxyribonucleic acid):脱氧核糖核酸dNTP(deoxyribonucleoside triphosphate):脱氧核苷三磷酸EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid):乙二胺四乙酸LAMP(loop-mediated isothermal amplification):环介导恒温扩增oppA:肺炎克雷伯氏菌周质寡肽结合蛋白基因Triton X-100:聚乙二醇辛基苯基醚 SN/T 2754.8—-20116技术概要根据肺炎克雷伯氏菌特有的靶序列oppA基因(参见附录 A)设计的两对特殊的内、外引物，特异性识别靶序列上的六个独立区域,利用 Bst 酶启动循环链置换反应，在 opA基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环 DNA 混合物；从 dNTP 析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²+结合，产生副产物（焦磷酸镁)形成乳白色沉淀，加人显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。7试剂和材料除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T 6682中一级水的要求。7.1引物：根据肺炎克雷伯氏菌特有的靶序列oppA基因设计一套特异性引物，包括外引物1(F3）,外引物2(B3),内引物 1(FIP),内引物2(BIP)。外引物扩增片段长度：193bp。F3(5′-3′): TACGCCCCGGTCTGACB3(5′-3′):GCGCTTTCACCCCCAACFIP(5-3) :GGCGAGACCAGTCGT