SN_T 3750-2013苹果壳色单隔孢溃疡病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3750—2013苹果壳色单隔孢溃疡病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Botryosphaeria stevensii Shoemaker2013-11-06发布2014-06-01实施中华人民共和国发布0国家质量监督检验检疫总局 SN/T言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院本标准主要起草人：王卫芳、张秋娥、黄英、严进、华丽。I SN/T 3750—2013苹果壳色单隔孢溃疡病菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了植物检疫中苹果壳色单隔孢溃疡病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于苹果壳色单隔孢溃疡病菌所有寄主植物的原木、枝条、苗木和果实的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3原理依据苹果壳色单隔孢溃疡病菌的为害症状、菌落特征、病菌的无性型和有性型形态进行该病菌的检疫鉴定。4试剂及仪器设备4.1培养基及试剂马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA：每1000mI/PDA由:200g去皮马铃薯，20g葡萄糖，18g琼脂配制而成）、燕麦琼脂培养基（OA：每1000mLOA油30g燕麦片，20g琼脂配制而成），100%乳酸、1%的次氯酸钠（NaOC1）、70%乙醇、无菌水。4.2仪器与设备立体显微镜、生物显微镜（具油镜和测微尺）、普通天平（感距0.1.g）、超净工作台、生物培养箱、高压灭菌器、载玻片、盖玻片、打孔器（直径4mm）：5检疫与鉴定5.1症状检查检查抽取的原木、木制品、枝条和苗木树皮的表面是否有溃疡，枝条是否有枯死症状，检查果实是否有腐烂症状（症状描述和图片参见A.3、图B.1)。按SN/T2122抽样，将有可疑症状的样品带回实验室作进一步检验。5.2实验室鉴定5.2.1样品中的病菌形态学观察从树皮上采集子实体，横切片后，将切片组织转移到滴有无菌水的载玻片上，在常温下晾干后加1 SN/T3750—20131滴100%乳酸并盖上盖玻片，制成非永久性玻片。观察子实体（尤其是子座）的形态特征，记录分生孢子、产孢细胞或者子囊、子囊孢子的形态。分别测量50个子囊孢子、子囊、分生孢子和产孢细胞、10个无性型子座和10个有性型子座的大小，拍摄并保存数码照片，同时将子实体转人培养基中纯化保存。5.2.2分离培养在样品中如果没有发现病原菌的子实体，则采用组织分离培养法，分离病部的病原菌。取发病部位的病健交界组织，切成4mm×4mm的小块，用1%的Na0Cl表面消毒10min，无菌水冲洗3遍，置于直径9cm的PDA平板上，每皿放4～6块，于25℃条件下12h黑暗/光照培养，将长出的菌落边缘的菌丝转至新的PDA平板上纯化。5.2.3分离物培养性状和形态学观察将纯化后的菌株在PDA平板上培养6d，采用火焰消毒的打孔器从菌落上打取直径4mm的菌丝体块，转移到新的PDA平板上，在全黑暗条件下，分别于20℃、25℃进行培养，每处理重复3次，观察菌落形态、计算菌落的生长速度、分生孢子器形成的速度。待分生孢子器形成后，观察分生孢子器及分生孢子的形态，测量其大小，拍摄并保存数码照片。6鉴定特征6.1菌落特征在PDA平板上，菌落圆形，初期白色，培养5d～6d后呈深橄榄色，且有大量的气生菌丝生成，在20℃、25℃黑暗条件下菌落生长速率分别为6mm/d、11mm/d。培养至6d菌落中央即现纠结成粒状的大量黑褐色分生孢子器。培养至9d少量的分生孢子器顶部即现白色黏稠状分生孢子团，培养至15d整个培养皿布满黑褐色分生孢子器，并且喷出大量白色孢子团（菌落特征图参见图B.2）。6.2无性繁殖器官的形态分生孢子器，单生或聚生，埋生于黑色的子座上，成熟时部分开裂，深褐色至黑色，近球形，直径可达600m，壁由三层组成，外层黑褐色，由厚璧细胞组成，中间层由深褐色的薄壁细胞组成，内层由透明的薄壁细胞组成。孔口居中，圆形，具乳突。分生孢子梗圆柱形，透明，无隔膜，极少数分支具隔膜。产孢细胞[（11～）12～15]μm×（45）μm，外生芽殖型产孢，离散，圆柱形，透明，光滑，无限生长。分生孢子器成熟后喷射出白色分生孢子团。分生孢子透明，光滑，厚壁，长椭圆形至卵形，大小[（23.5～）25.1～25.7(~27.4)Jμm×[(12.4～)13.2～13.5(～14.3)Jμm,平均大小为(25.4±1.0)μm×(13.4±0.5)μm.长/宽比率为1.9士0.1。分生孢子初