SN 1687-2005马流感血凝抑制试验操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1687--2005马流感血凝抑制试验操作规程Protocol of haemagglutination inhibition test for equine influenza2005-09-30 发布2006-05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1687—2005前言本标准参考了OIE《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》2004版。本标准的附录 A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局。本标准主要起草人：张利峰、张鹤晓、刘继红、谷强。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1687—2005马流感血凝抑制试验操作规程1 范围本标准规定了马流感血凝抑制试验方法。本标准适用于马流感病毒(H)亚型的鉴定，及其由马流感病毒引起的马流感的诊断、流行病学调查、检疫和监测。2缩略语下列缩略语适用于本标准。2. 1HA血凝试验2. 2HI血凝抑制试验2. 3PBS磷酸盐缓冲液2. 4RBC红细胞3材料准备3.1号器材V型96孔微量滴定板、微量移液器、采血管、微量混合器、离心机。3.2抗原马流感病毒亚型1(H7N7)和马流感病毒亚型2(H3N8），由国家有关主管部门认可的或指定的供应商提供，处理方法见第A.3章。3.3 鸡红细胞鸡红细胞的准备见第 A.4 章。3.4血清3. 4. 1标准阳性血清由国家有关主管部门认可的或指定的供应商提供。3.4.2被检血清采集及前处理在马颈部上三分之一处静脉采血 10 mL,分离血清并处理后用于检测,马血清前处理方法见第 A.5章，若需较长时间检测，可置于4℃或一20℃。4操作方法4. 1 微量血凝试验(HA)4.1.1取干净的V型96孔微量滴定板一块，按表1进行操作：每孔加25μLPBS液；孔1加人前处理过的马流感病毒抗原25μL，用微量移液器反复吹打混匀；吸出25μL于孔2,吹打混勾后吸出25μL于孔3，如此依次按1：2倍比稀释到孔11,第11孔弃去25μL，最后1孔不加抗原作对照。4.1.2抗原稀释完后，每孔补加PBS25μL。孔12不加抗原，只加PBS液做空白对照。4.1.3每孔加人50 μL 1%鸡红细胞悬液,轻轻振荡混匀，在适宜温度 22℃左右静置作用 30 min,HA1 SN/T 1687—2005滴度为红细胞出现凝集的最高稀释倍数。抗原血凝滴度的测定应设置4个重复，取其中位值。单位为微升表 1 马流感血凝试验111210n8924孔号13门对照: 256|1:512|1:1024|1:20481: 128|1 :1:81:21:4:163抗原稀释度2550252525252502525PBS 液252525 25252.52525202525抗原5050505050505050 505050001%红细胞在适宜温度 22℃左右静置作用30 min+判定举例+注：马流感抗原的血凝滴度为红细胞出现凝集的最高稀释倍数。因此，能使红细胞出现凝集的最高稀释倍数的病毒液25μL称为1个血凝单位(HA)。如某马流感抗原的血凝滴度是1：128,那么1：128稀释的该病毒抗原25 μL 即为 1 个 HA 单位。在进行马流感血凝抑制试验时,病毒抗原的工作浓度应为 4 个 HA 单位。如果该病毒抗源的工作浓度为1：32,那么25μL1：32的稀释抗原含有4个HA单位。4.2 血凝抑制试验(HI)4.2.1取干净的96孔微量滴定板一块，按表2进行操作：每孔加25 μL.PBS。4.2.2孔1加待检血清25μL，用微量移液器反复吹打混匀；吸出25μL于孔2,吹打混匀后吸出25μL于孔3,如此依次稀释到孔10。孔10混匀后吸出25μL弃掉。最后2孔不加血清，分别做抗原对照和不加血清的空白血凝对照。稀释抗原，含量为4个HA单位（4×最小凝集量，即滴度/4）。4.2.3每孔中加25μL抗原，充分振荡后，在适宜温度22℃左右静置作用30min。4. 2. 4每孔加50μL1%鸡红细胞液，充分振荡后，在适宜温度22℃左右静置作用30min。4.2.5将滴定板倾斜70°判读结果。4.2.6单位为微升马流感血凝抑制试验表 21112 10孔号5623空白抗原1:641:128|1:256|1:512|1:10241:1611: 32118血清稀释度1:2:4对照对照752525502525252525252525PBS 液2525 25252525252525待捡血清2525 25252525252525254HA抗原2525在适宜温度22℃左右静置作用30 min50605050505050501%红细胞50u在适宜温度22℃左右静置作用30min判定举例马