SN_T 3569-2013植原体活体菌株保存方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3569-2013植原体活体菌株保存方法Methods for the preservation of phytoplasma strain culture2013-03-01发布2013-09-16实施中华人民共和国发布站州2405国家质量监督检验检疫总局、副涂层查真伪 SN/T 3569-—2013言前本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国林业科学研究院。本标准主要起草人：赵文军、牟海青、田国忠、宋传生、林彩丽、朱水芳、郭民伟。1 SN/T 3569—2013植原体活体菌株保存方法1范围本标准规定了植原体活体菌株保存方法。本标准适用于植原体活体菌株保存。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T2010—2007　植原体脱除方法3原理3.1植原体转性寄生于植物的韧皮部，无细胞壁，仪由三层膜包被，无法进行体外人工培养。因无细胞壁，故容易受到外部环境条件的影响，如植物体内水分的吸收、胞液的浓度及胞间的渗透压，使其呈现多型性。3.2植原体主要通过取食植物韧皮部汁液的叶蝉,蚜虫、飞虱等昆虫介体传播，枣疯病植原体的传播主要通过中华拟绫纹叶蝉（Hishimonns chinensis Ahufriev）：凹缘绫叶蝉（Hishimonus sellatus Uhler），1311橙带叶蝉（Hishimonus aurifacialla Kuah)和红肉小蝉(Typhlocypa pp.)传播。苑丝子传播。丝子是二种寄生性植物，通过与寄主建立共同的输导3.3植原体也可经植物媒介-系统，从寄主植物内吸取营养的间时，植原体也能够通过输导系统从病株传播到健康植株。目前为止，还未有实验证明植原体能够像病毒那样通过种子和机械方法传播。人工传播植原体的有效方法是嫁接法。3.4根据植原体的生物学特性以及传毒特性制定本标准。相关资料参见附录A。4仪器设备、用具以及试剂4.1仪器设备电子天平（感量1/10000g）、人工气候箱、高压灭菌器、超净工作台、荧光显微镜、高速冷冻离心机、低速离心机、恒温水浴锅、低温冰箱、低温冷藏柜、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析仪、电动搅拌机、组织培养接种间和培养室等。4.2用具试管、组织培养瓶、剪刀、镊子、酒精灯、高温灭菌锅、移液器及其枪头、研钵、离心管、PCR.管、量筒、烧杯、花盆、防虫网罩、芽接刀。4.3试剂70%酒精、0.1%氯化汞。1 SN/T 3569—20135植原体活体保存方法5.1染病苗温室保存5.1.1田间病苗移栽将口岸截获或田间表现症状，并经鉴定确认植原体感染的幼苗或幼树.于休眠或发病季节连根挖出（带土），生长季节要注意枝干和根部保湿。将染病苗移栽至适宜大小的花盆内，于适宜温度（控制在25℃左右)和适宜湿度条件下促其萌芽和生长。感染不同类型植原体的病盆苗分别罩在不同的防虫网内，以避免昆虫传毒和交叉感染。5.1.2嫁接和介体传病与病苗繁殖嫁接取病树上适宜粗细的休眠或生长季节发病枝条（若已获得无菌组培病苗，可直接用染病外植体芽嫁接至盆栽苗），通过劈接或切接方式嫁接至盆栽健康砧木上，套塑料袋保湿，待嫁接接口愈合后去袋。观察记录盆栽砧木发病时间及症状。介体传病若已知植原体传播媒介昆虫，如传播泡桐丛枝病的茶翅蝽（Halyomorpha picus），传播枣疯病的中华拟菱纹叶蝉，可在病株上采集带毒昆虫成虫，将其移至相应的盆栽健康寄主植物的幼嫩枝叶上取食传毒1周以上，单株接虫5头以上，然后杀虫。在适温弱光照条件下促其发病。此外，可以将健康昆虫成虫于发病植株上饲毒3周左右，再在健康植物上进行取食，达到传毒的效果。多数植原体侵染长春花（Catharanthusroseus），并表现丛枝、小叶、黄化和花绿变等症状.是植原体繁殖和长期保存的理想寄主。可通过介体昆虫或苑丝子将植原体转接到长春花上繁殖和保存。扩繁病苗或病菌转接时，取盆栽病苗的枝芽，嫁接到健康苗上，在正常室温条件下诱导发病。5.2组织培养保存5.2.1 染病植株采集与处理采集田间表现典型症状的枝条顶梢及下部半木质化部分，放于密封塑料袋内，于冷藏条件下带回实验室。剪掉嫩枝大叶片，截成2cm～3cm左右的具节芽茎段，放在1.烧杯内，用适量洗涤灵或洗衣粉充分洗涤两遍以上，加盖纱布在流动自来水下冲洗2h以上或过夜。带病休眠枝条采回实验室后需在水培条件下促其萌芽，然后取萌芽作为外植体消毒，病根先要理根育苗，待苗长