SNT 1692.2-2006非洲马瘟血球凝集和血球凝集抑制试验操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1692.2—2006非洲马瘟血球凝集和血球凝集抑制试验操作规程Protocol of haemagglutination and haemagglutination-inhibition testfor African horse sickness2006-01-26发布2006-08-16实施中华人民共和国B发布林冠 验的成国家质量监督检验检疫总局“数码防伪 SN/T 1692.2--2006前言SN/T1692分为三部分：一非洲马瘟琼脂免疫扩散试验操作规程；非洲马瘟血球凝集和血球凝集抑制试验操作规程；非洲马瘟补体结合试验操作规程。本部分为SN/T1692的第2部分。本部分的附录A为规范性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国云南出人境检验检疫局。本部分主要起草人：花群义、董俊、周晓黎、杨云庆、龙忠保。本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标推。 SN/T 1692.2—2006非洲马瘟血球凝集和血球凝集抑制试验操作规程1 范围SN/T 1692 的本部分规定了非洲马瘟斑凝和血凝抑制试验的方法。本部分适用于马属动物非洲马瘟的检疫、疫情监测和流行病学调查。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过SN/T1692的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究匙否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3试剂和材料3.1试剂纯度除另有说明外，所有的化学试剂均为分析纯。实验用水应符合GB/T6682的要求。3.2生理盐水的配制配制方法见附录 A。3.3pH9.0硼酸盐缓冲液(BS)配制方法见附录A。3.4磷酸盐缓冲液(PBS)配制方法见附录A。3.5红细胞保存液配制方法见附录3.6红细胞稀释液配制方法见附录A3.70.3%红细胞悬液和1%红细胞悬液配制方法见附录A。3.8 25%白陶土溶液配制方法见附录A。3.9标准试剂3.9.1非洲马瘟血凝素，由指定单位提供。3.9.2非洲马瘟阳性血清，由指定单位提供。3.9.3非洲马瘟阴性血清，由指定单位提供。3.10器材架盘天平、分析天平、离心机、96孔V型微量血凝板、微型振荡器、10mL.真空采血管、可调移液器及加样滴头、恒温箱、普通冰箱等。3.11试验动物健康青年马(1岁～2岁)。1 SN/T 1692.2--20064样品处理4.1采样无菌采取被检动物血液10 ml,待血液凝固后，以 2000 r/min离心10 min，分离血清，血清 4℃保存备用。若需长期保存，则置于一20℃。4.2＇被检血清的处理被检血清和吸附剂（pH9.0硼酸盐缓冲液和25%白陶土溶液按4：5混合）按1：1混合后，在室温下充分振荡30min，再经56℃灭活30min，然后2500r/min离心30min，取上清加人1倍体积的1%健康马红细胞生理盐水悬液，摇匀后在室温下静止30min，再经1000 r/min离心15 min，取上清，即为1：4 试验血清。5操作方法5. 1血球凝集试验5. 1. 1 血球凝集试验见表 1。表 1 非洲马瘟血球凝集试验1011孔号23456A8912三1 t 32641 : 128|1 + 256[1115121：10241:2048对照血凝素稀释度1:2181 : 161125252511 2512525 12512525252525生理盐水/μ2525 2525252525一奔去血凝素/μL2525252525252525252525BS 缓冲液/μL2550505050505050505050500.3%红细胞悬液/uL50感作室温(22℃～25℃)中静置1 h左右判定++++++++++++++十注：+十++表示红细胞已100%凝集，呈一层薄膜状，凝集颗粒均匀分布于整个孔底；十++表示红细胞约75%凝集，但孔底仍有红细胞沉淀成滴状,周围已形成膜状；十十表示红细胞约50%凝集，血滴周围有凝集颗粒，但不呈膜状;十表示红细胞约25%凝集，血滴周围仅有少置的凝集颗粒；一表示红细胞0%凝集，呈圆滴状沉淀于孔底.周围无凝集颗粒。5.1.2取96孔V型微量血凝板，按表1标记，每孔均加人25μL生理盐水，第一孔加人25uL血凝素，充分混匀后吸25μL至第二孔作等量倍比稀释至倒数第二孔，并从倒数第二孔中吸去 25μL。最后孔不加血凝素作为红细胞对照。5.1.3每孔加BS缓冲液25μL，在微型振荡器上充分摇匀，室温（22℃～25℃）放置45min。5.1.4每孔加人0.3%红细胞悬液50μ