SN 1686-2005新城疫病毒中强毒株检测方法 荧光RT-PCR法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1686—2005新城疫病毒中强毒株检测方法荧光 RT-PCR 法Detection of mesogenic and velogenic strains of newcastle disease virus-Method of the real-time RT-PCR2005-09-30 发布2006-05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1686—2005前言本标准的附录 A为规范性附录,附录 B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局。本标准主要起草人：张鹤晓、刘环、高志强、张利峰、谷强、王甲正。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1686-—2005新城疫病毒中强毒株检测方法荧光 RT-PCR 法1 范围本标准规定了新城疫病毒中强毒株 TaqMan 实时荧光 RT-PCR检测方法。本标准适用于禽类及其产品新城疫病毒中强毒株的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。·凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T19438.1--2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法3缩略语下列缩略语适用于本标准。3.1荧光 RT-PCR 荧光反转录-聚合酶链反应。3.2 Ct 值每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环圈数。3.3 RNA 核糖核酸。3.4 Taq 酶 Taq DNA聚合酶。3.5 PBS磷酸盐缓冲生理盐水。3.6DEPC 焦碳酸乙二酯。4原理采用 TaqMan 方法,在比对新城疫病毒 F 基因序列的基础上,设计针对 F基因的特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示），3端标记TAMPA荧光素为淬灭荧光基团（用Q表示），它在近距离内能吸收5端荧光基团发出的荧光信号。PCR反应进人退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶的5-→3的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行,PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。5检测实验室的设置与管理中强毒株新城疫病毒荧光RT-PCR检测实验室的标准化设置与管理见GB/T 19438.1—2004附录 C。6　试剂和仪器6. 1 试剂除另有说明，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。 SN/T 1686---20056.1.1 三氯甲烷。6.1.2 异丙醇：--20℃预冷。6.1.375%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水(符合GB6682要求)配制，一20℃预冷。1 mol/L(pH 7.2)的PBS:配方见附录 A。（121±2)℃,15 min高压灭菌冷却后，无菌条件下加人青霉素、链霉素各10000IU/mL。6.1.5中强毒株新城疫病毒荧光 RT-PCR检测试剂盒1试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附录B。6.2仪器设备高速台式冷冻离心机：最大离心力12000r/min以上。6.2.17荧光 PCR检测仪、计算机。6.2.22℃～8℃冰箱和-20℃冰箱。6.2.32微量移液器:0. 5 μL～10 μL,5 μL～~20 μL,20 μL~200 μL,200 μL~1 000 μL。.5组织匀浆器。6.2.6混匀器。7样品的采集与前处理采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。7.1取样工具7. 1.1棉拭子、剪刀、镊子、研钵、Eppendorf 管。7.1.2所有上述取样工具必须经(121士2)℃,15 min高压灭菌并烘干或经160℃干烤2 h。7.2采样方法7.2.1活禽样品咽喉拭子采样，采样时要将拭子深人喉头及上聘裂来回刮3次～5次，取咽喉分泌液。泄殖腔拭子采样,将拭子深人泄殖腔转一圈沾取粪便。将采样后的咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放人盛有 1.0 mL PBS 的 Eppendorf 管中，编号备用。7.2.2内脏或肌肉样品用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品2.0g于研钵中充分研磨，再加10mLPBS混匀，或置于组织匀浆器中，加人10.mL PBS匀浆，然后将组织悬液转人无菌Eppendorf管中3000r/min离心10min，取上清液转人另一无菌Eppendorf 管中,编号备用。7.2.3血清或血浆用无菌注射器