SN_T 5101-2019国境口岸阿穆尔病毒实时荧光RT-PCR检测方法.pdf

ICS 11.020C 62SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 5101--2019国境口岸阿穆尔病毒实时荧光RT-PCR 检测方法Detection method for Amur virus by real-time fluorescenceRT-PCR at frontier ports2019-09-03 发布2020-03-01实施中国西讯出版社有限公司中华人民共和国海关总署发布HG944440005789适网址：［，刮开涂层激活密码‘ SN/T 5101--2019前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国长春海关、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国长白海关。本标准主要起草人：刘阳、洪晓坤、姚李四、王玮琳、丁旭、刘勇先、孙舒、张吉、孙晶莹。 SN/T 5101—2019国境口岸阿穆尔病毒实时荧光RT-PCR检测方法1范围本标准规定了国境口岸入出境人员及鼠类感染阿穆尔病毒的荧光RT-PCR检测方法，包括样本采集、处理，检验、结果判定、报告和生物安全措施、本标准适用于国境口岸人出境人员及鼠类感染阿穆尔病毒的荧光RT-PCR检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室　生物安全通用要求WS/T 230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒)种或样本运输管理规定（原中华人民共和国卫生部令第45号）人间传染的病原微生物名录（原中华人民共和国卫生部卫科教发［2006115号）3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1阿穆尔病毒‧Amur virus属于布尼亚病毒科（Bunyaviridue），汉坦病毒属（Hantauirus），一种新发现的种群分型，是分节段的负链RNA病毒。引起以鼠类为主要传染源的肾综合征出血热，典型临床表现为发热、出血、充血、低血压休克及肾脏损害。3.2 reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR逆转录聚合酶链反应将 RNA的逆转录(RT)和 cDNA 的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。本标准采用一步法逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR）。在--步法 RT-PCR 中，首先以 RNA 为模板，利用下游特异性引物，在依赖RNA的 DNA聚合酶(逆转录酶)的作用下转录合成互补DNA（cDNA），该步称作逆转录”；随后，再以cDNA为模板，利用上游和下游特异性引物,在 DNA聚合酶的作用下进行 PCR循环扩增；最终使RNA分子的某个特定区域（目的片段)被扩增达几百万倍。3.3实时荧光 RT-PCR. real-time fluorescence RT-PCR通过荧光染料或荧光标记的特异性荧光探针，对反转录后PCR扩增的产物进行标记跟踪，利用荧光信号累积实现实时在线监测整个PCR反应过程，结合相应的软件可以对结果进行定性和定量分析。1 SN/T 5101—2019本标准加人一对引物的同时加人一条特异性荧光探针，探针两端分别标记荧光报告基团(FAM)和荧光淬灭基团(BHQ1),PCR扩增时,利用 Taq 酶的水解作用,使探针上的荧光报告基团远离淬灭基团从而发出荧光信号，荧光检测系统可接收到荧光信号，此方法检测的是积累的荧光信号。3.4Ct 值 cycle threshold在荧光PCR中，每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。4　缩略语下列缩略语适用于本文件。BHQl:一种荧光淬灭基团(bhql quenching group)DEPC:焦碳酸乙二酯(diethyl pyrocarbonate)DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)FAM:6-羧基-荧光素(6-carboxy-fluorescein)PCR:聚合酶链反应(polymerase chain reaction)Tm值:核酸融解温度(melting tempreture)5 检测对象按照国境口岸发现的有发热、出血、充血、低血压休克等肾综合征出血热状症，疑似阿穆尔病毒感染的染疫嫌疑人及密切接触者。入出境交通工具、运输设备、货物、行李、邮包等和口岸内的鼠类。6生物安全和 PCR防污染要求6.1实验室生物安全应符合GB19489 和《人间传染病的病原微生物名录》的规定。6.2　PCR防污染措施按WS/T230的规定执行。6.3样本运输应按照《可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定》的相关规定。1仪器7.1实时荧光 PCR仪及配套