SN 1454-2004鸡马立克氏病病毒分离与鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1454—2004鸡马立克氏病病毒分离与鉴定方法Isolation and identification for Mareks disease virus of chicken2004-06-01发布2004-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1454—2004前言本标准的附录 A、附录 B均为规范性附录。本标推由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国陕西出人境检验检疫局和山东出人境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人：陈茂盛、管恩平、马玉玲、寇改霞。本标准为首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1454---2004鸡马立克氏病病毒分离与鉴定方法1 范围本标准规定了鸡马立克氏病病毒(MDV)的分离鉴定方法。本标适用于鸡马立克氏病(MD)流行病学调查和口岸检疫。2材料准备2.1一日龄 MD敏感鸡:用 SPF种蛋孵化。2.2鸭胚成纤维细胞(DEF)的制备：见附录 A。2.3鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备:同 2.2。2.4细胞培养液的制备;见附录 B。2.5淋巴细胞分层液。2.6标准的 MDV分型单克隆抗体。2.7缓冲溶液配制：磷酸盐缓冲液(PBS);含0.05%吐温-20的PBS。以上溶液配制方法见附录B。2.8标准 MDV:MDV I型病毒GA毒株。3采样挑选临床发病的 MD疑似病鸡，无菌采集枸橡酸钠抗凝全血5mL/鸡～10 mL/鸡,加人淋巴细胞分层液200g离心5min，分离收集淋巴细胞，并用无菌PBS洗涤两次，用细胞维持液稀释成10？个/mL淋巴细胞的细胞悬浮液直接使用或者加人15%的二甲基亚砜后保存在液氮（-196℃)中备用。4　操作方法4.1接种和培养取生长良好的DEF单层，弃去维持液，接种0.2mL处理好的淋巴细胞悬浮液，置含5%二氧化碳的培养箱,37℃下吸附 1.5 h。补充适量维持液继续培养,24 h内换液一次,以后每2 d～3d换液一次。在培养过程中每日观察细胞病变(CPE)产生情况,同时设立不接种样品的空白细胞对照瓶。4.2收集在空白细胞对照瓶的细胞生长良好的前提下,将产生广泛CPE(蚀斑形成面积占30%以上)的DEF单层培养瓶中的维持液弃去，用0.01%胰酶消化，加细胞生长液制成细胞悬浮液直接供鉴定用，或者加二甲基亚砜后置液氮（一196℃)中保存备用。4.3克隆将收集的具有广泛 CPE的细胞悬浮液进行稀释,接种于 96孔细胞培养板,使每孔平均含有1个细胞，继续培养至孔内产生CPE。选择只有单个病灶的孔，吹打下孔壁细胞，移入细胞培养瓶扩大培养。同法重复克隆二至三次。所收集的培养物就是供鉴定用的MDV分离物。 SN/T 145420045 鉴定5.1电镜观察将MDV分离物按照常规方法制成超薄切片，磷乌酸负染，用电子显微镜观察病毒的形态和大小。5.2蚀斑测定用MDV分离物接种CEF次代单层，培养至72h，用测微器测量蚀斑大小，每份分离物至少测量10个蚀斑，取其平均值作为蚀斑大小的测定值。5.3单克隆抗体间接荧光染色试验将出现CPE的病毒分离物接种到放置盖玻片的细胞管,置二氧化碳培养箱中培养观察。当出现明显的病毒蚀斑时,取出管内盖玻片，以冷的甲醇(一20℃)在 4℃条件下固定15 min，然后用 PBS冲洗三次（每次5min）,再滴加MDV分型单克隆抗体，放人37℃的水浴中作用90min～120min，用PBS冲洗三次（每次5min）,滴加抗鼠免疫荧光抗体，在37℃水浴中作用30 min，用含0.05%吐温-20的 PBS冲洗三次(（每次5min)，然后用荧光显微镜检查细胞内荧光出现情况。5.4毒力鉴定用2000个蚀斑形成单位(PFU)的MDV分离物和2000个PFU的GA标准强毒株分别接种一日龄易感鸡20只～25只，同时设立相同数日的易感鸡对照组。分别隔离饲养10周，观察记录死亡情况，并剖检死亡鸡。隔离饲养期满，实验鸡全部剖杀作肉眼病理检查。6 结果判定6.1MDV在电子显微镜下表现为近似圆形或者六角形的病毒颗粒或者核衣壳，多数出现在感染的细胞核中，偶见于细胞浆中，大小为85 nm～100 nm6.2 MDV 病毒可以在 DEF或者 CEF单层上产生蚀斑,蚀斑大小一般在 1 mm 之内。血清 I 型产生的蚀斑较小，血清Ⅱ型产生大合胞体的中等蚀斑，血清Ⅲ型产生大的蚀斑。6.3经特异单克隆抗体间接荧光染色，在荧光显微镜下感染细胞将呈现清晰闪亮的黄绿色荧光。根据出现荧光的感染细胞所使用的单克隆抗体，可以确定MDV分离毒株为相应的血清型。6.4同时符合 6.1、6.2、6.3三个试验结果的MDV分离物即可以判定为 MDV,并确定其血清型。 SN/T 1454--2004附 录 A(规范性附录)鹅胚(鸡