SN_T 3731.3-2013食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法 第3部分：鸽子成分检测　 实时荧光PCR法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3731.3--2013食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第3部分：鸽子成分检测实时荧光 PCR 法Identification of poultry ingredient in food and feed-Part 3 :Detection of dove ingredient-Real-time PCR method2013-11-06 发布2014-06-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3731.3-2013前言SN/T3731《食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法》共分为以下6个部分：第1部分：鹤鹑成分检测PCR法；第2部分：鹅成分检测　PCR法；第3部分：鸽子成分检测　实时荧光PCR法;-第4部分：火鸡成分检测　实时荧光PCR法；第5部分：鸭成分检测　PCR法；第6部分：鹧鸪成分检测实时荧光PCR法。本部分为SN/T3731的第3部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。本部分主要起草人：宗卉、张彩虹、曹琛福、张慧霞、陈颖、黄文胜、刘建利、吕建强、杨俊兴、卢体康、花群义。1 SN/T 3731.3--2013食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第3部分：鸽子成分检测实时荧光PCR 法1 范围SN/T3731的本部分规定了食品及饲料中鸽子(家鸽+成分检测的实时荧光PCR方法。本部分适用于食品及饲料中鸽子（家鸽)成分的定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件3.1实时荧光 PCR real time PCl在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。3.2Ct 值 cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonuleic acid)dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate)PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)ROX:6-羧基-X-罗丹明(6-carboxyl-X-Rhodamine)CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammonium bromide)Tris:三（羟甲基)氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]EDTA:乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid)5方法提要样品经研磨混匀后，提取 DNA，以DNA为模板，采用鸽子线粒体16 s RNA基因特异性检测引物1 SN/T 3731.3—2013和探针进行实时荧光PCR扩增，根据Ct值，判断样品中是否存在鸽子成分。6试剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。6.1检测用引物（对)序列和探针鸽子成分扩增引物和探针详见表1。表1试验用引物和探针名称序列(5-3)目的基因鸽子成分5端引物F :5′-GAGCAACCCCTCAACGTACT-3鸽子线粒体16s鸽子成分3端引物R: 5′-ACCTCCTCGTCGATATGGACTC-3RNA基因鸽子成分探针P:5-FAM-CCCCTCAACGTACTAACAGTAACCAGAC-ECLIPSE-36.2 试剂6.2.1裂解液:1% CTAB;0.05 mol/L Tris-HCI(pH8.0);0.7 mol/L NaCl;0.01 mol/L EDTA(pH 8.0)。6.2.2 DNA 聚合酶。6.2.32×荧光 PCR缓冲液。6.2.4硫酸镁。6.2.5dNTP 混合液。6.2.6ROX染料。6.2.7三氯甲烷。6.2.8异丙醇。6.2.975%乙醇。6.2.10双蒸水。7仪器和设备7.17离心机（最大离心力大于12000g）。7.2↑微量移液器(100 μL～1 000 μL,20 μL～200 μL,2 μL～20 μL,0.5 μL～10 μL)。7.3实时荧光PCR仪。7.41恒温水浴锅。7.5天平：感量0.001g和0.1g。7.6涡旋振荡器。7.7 pH计。8检验步骤8.1样品制备称取待检样品