动物基因工程—目的基因的获取.pptx

动物生物技术目的基因的获取目的基因的获取 在基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因，称为目的基因。目的基因一般是结构基因，也就是能够转录和翻译出蛋白质的基因。选用怎样的目的基因是基因工程设计必须优先考虑的问题，如何分离获得目的基因是基因工程操作的重要技术之一。目的基因的获取1、目的已基因的来源 目的基因来源非常广泛，主要来源于各种生物。它们染色体基因组中蕴藏着大量的基因。生物种类 基因数目（万个） 人3~4 拟南芥2.55 果蝇1.36 水稻5 蠕虫1.78 流感病毒0.178 单个基因在基因组中所占比例极其微小，加上复杂的基因间序列，所以，对单个目的基因分离如同大海捞针。酶切直接分离法PCR扩增法基因组文库或cDNA文库法化学合成法目的基因的获取2、分离目的基因的途径获取目的基因的途径有四种主要方法GATCC GGCCTAGGGATCCCCTAGG+①定义： 是一类以环形或线形双链DNA为底物，能识别DNA中特定核苷酸序列，并在合适反应条件下使每条链的一个磷酸二酯键断开，产生具有3’－OH和5’－P基团DNA片段的内脱氧核苷酸酶。目的基因的获取2、分离目的基因的途径（1）限制性内切核酸酶的定义、分类提到的限制性内切酶都是指II型酶I型限制性内切酶：兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多个亚基的蛋白复合体，它可以在识别位点很远的地方任意切割DNA链。II型限制性内切酶：在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链，产生确定的限制片段，是三类限制性内切酶中唯一用于基因工程操作的酶。 III型限制性内切酶：在识别位点之外切开DNA链，并且要求识别位点是反向重复序列，它们很少能产生完全切割的片段。 目的基因的获取2、分离目的基因的途径②分类目前发现的限制性内切核酸酶有3000多种，可分为： 左右互补对称，称为回文序列 识别序列 每种限制性内切核酸酶都有相应的识别序列（4-8bp） EcoRⅠ的识别序列为： GAATTCHind III的识别序列为： AAGCTT CTTAAG TTCGAABamH I的识别序列为：GGATCCSau3A的识别序列为：GATC CCTAGGCTAG Mae III的识别序列为：GTNACDra Ⅱ的识别序列为：PuGGNCCPy CANTG PyCCNGGPu 目的基因的获取2、分离目的基因的途径（2）限制性内切核酸酶的作用机制识别序列可以以5’-3’走向的单链DNA表示。如Hind III的识别序列可以写为：AAGCTT 左右互补对称，称为回文序列 识别序列 有的限制性内切核酸酶可识别两种以上的核苷酸序列AccⅠ即可识别GTATAC，又可识别GTCGAC；DdecⅠ识别的序列：CTAAG，CTTAG，CTGAG，CTCAG 目的基因的获取2、分离目的基因的途径（2）限制性内切核酸酶的作用机制GACCTGGATCC GHindⅡGTCGACCAGCTGGGATCCCCTAGGBam HⅠGTCCAG++（b）酶切位点DNA在限制性内切核酸酶的作用下，多聚核甘酸链上磷酸二酯键断开的位置被称为酶切位点，可用↓表示，有平端切口和粘断切口之分。平端切口粘端切口目的基因的获取2、分离目的基因的途径（2）限制性内切核酸酶的作用机制GCCTAGGATCC GGATCC GGCCTAGGCCTAGGGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGGBam HⅠ+BstⅠ+目的基因的获取2、分离目的基因的途径（3）同功异源酶（同裂酶）来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶，也称同裂酶。 GATCT A GATCC GATCTAG AGATCT TCTAGAGCCTAG GGATCC CCTAGGBg I ⅡBam HⅠ++目的基因的获取2、分离目的基因的途径（4）同尾酶： 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end) GATCT A GATCC GATCTAG AGATCT TCTAGAGCCTAG GGATCC CCTAGGBg I ⅡBam HⅠ++目的基因的获取2、分离目的基因的途径（4）同尾酶： 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)目的基因的获取2、分离目的基因的途径（5）限制性内切核酸酶的反应体系： 反应底物：环状或线状的双