SN 1172-2003鸡白血病检测方法 琼脂免疫扩散试验.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1172—2003琼脂免疫扩散试验鸡白血病检测方法Detection avian leucosis/sarcoma antigens-?Protocol of agar gel immunodiffusion tes!2003-03-17 发布2003-09-01实施中华人民北和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1172--2003前言本标准主要参考《中华人民共和国进出境动物检疫规程手册》1997)第2.6.12的内容而制定。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人：叶奕优、黄运生、杨宝华。本标准系首次发布的检验检疫行业标推。一 SN/T 1172—2003引言禽白血病肉瘤复合症是由禽白血病肉瘤病毒群引起的禽类(主要是鸡)多种具有传染性的良性和恶性肿瘤,在自然条件下最常见的是淋巴细胞性白血病,其次为成红细胞性白血病、成髓细胞性白血病、骨髓细胞瘤、内皮瘤、纤维肉瘤和骨化石等。大多数肿瘤与造血系统有关，少数侵害其他组织。本病在自然条件下只有鸡能感染。传染源为病鸡和带毒鸡，尤其是带藓鸡在本病传播中起着重要作用。有毒血症的母鸡，本身没有症状而生下的蛋常带有病毒，孵出病雏带毒，它再与健康雏鸡接触时可以扩大传染到整个鸡群。先天感染的雏鸡常有免疫耐受现象，它不产生抗肿瘤病毒抗体，长成母鸡后，长期带排毒，成为重要的传染源。后天接触感染的雏鸡的带毒排毒现象与接触感染时雏鸡的日龄有很大关系，雏鸡在2 周龄以内感染这种病毒，发病率和死亡率很高,残存母鸡生下的蛋带有病毒的比例也很高。4 至8周龄鸡感染后，发病死亡数大大降低，10周龄以上的鸡则可以不发病，其蛋不带毒。此病世界各国均有存在，一些养鸡业发达国家，大多数鸡群都感染此病。我国农业部于1992年公布的《进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》把该病列入二类传染病名录中。该病的诊断方法主要是病原学检查，方法有补体结合(CF)试验、抵抗力诱发因子(RIF)试验、表型混合(PM)试验、琼脂扩散试验、ELISA与荧光抗体试验，其中以PM 比较准确可靠，是目前世界上检查淋巴细胞性白血病病毒比较常用的方法，主要用于 SPF 鸡群的建立和监测,RIF试验可用于鉴定病毒亚群，琼脂扩散试验用于检测鸡体内禽白血病病毒群特异性抗原，操作简便，可作群体疫情监测。 SN/T 1172--2003鸡白血病检测方法琼脂免疫扩散试验1 范围本标规定了用已知鸽抗劳氏肉瘤病毒抗体，应用琼脂免疫扩散试验，检测鸡体内白血病病毒群特异性抗原。本标准适用于 5 日龄以上鸡的白血病的检疫、疫情监测以及流行病学的调查。2 试验原理琼脂糖是一种含有硫酸基的多糖体，高温时能溶于水，冷却后凝固形成凝胶，琼脂糖凝胶呈多孔结构，其孔径大小取决于琼脂糖的浓度。1%琼脂糖凝胶的孔径约85 nm，这一孔径范围能允许各种抗原抗体分子在琼脂糖凝胶中自由扩散，并由近及远形成浓度梯度，当二者相遇时，在比例适当处发生结合而形成沉淀，反应的沉淀物因其颗粒较大，故在凝胶中不再抗散，而形成沉淀带。根据有无沉淀带的形成判断是否存在相应的抗原抗体免疫反应，从而判断样品中是否存在相应的抗原。3 器材与试验准备3. 1 试剂3.1.1标准阳性血清：鸽抗劳氏肉瘤病毒血清，由指定单位提供。3.1.2标准抗原：禽白血病抗原,由指定单位提供。3.1.3琼脂糖。3.1.4硼酸缓冲液 pH8.6四硼酸钠8.8g硼酸4.65 g蒸馏水加至1 000 ml.3.1.51%硫柳汞溶液。3.1.6生理盐水。3.2器材3.2.1 天平。3.2.2外径5mm、孔距3mm的7孔梅花样金属打孔器，外径5mm打孔器。3.2.3玻璃棒(直径0.4 cm、长 15 cm)。3.2.4直径90 mm平Ⅲ。3.2.5直径15 mm长 110 mm试管。3.2.6 微量移液器(20 μL～200 μL)。3.3琼脂平板的制备3.3.1称取琼脂糖，用含0.01%硫柳汞的pH8.6的硼酸缓冲液制成1%琼脂糖溶液，隔水煮沸溶化1。3.3.2将直径90 mm的平血置水平台上，倒人3.3.1中配好的琼脂糖溶液约18ml,注意不要产生气泡,冷凝后将平血倒置放 4℃保存,2 周内使用。1）可用水浴锅或微波炉把琼脂糖隔水煮沸溶化。上 SN/T 1172—20033.3.3打孔：按图1或图2的图形打孔，孔径5.0mm，孔距3.0mm。孔内琼脂用针头小心挑出，勿磁坏周围琼脂，打孔结束后，将平板底部经过酒精灯火焰上方来回5次～？次封底，以防渗溺。图 1 样品少时使用?图 2 样品多时使用3. 4被检样品的处理用鸡的羽髓做被检材料，视鸡只的大小拔取2根～6根带髓翅羽，剪下带髓的羽轴基部，置于试管内，加生理盐水0.