SCT 7202.1-2007斑节对虾杆状病毒诊断规程 第1部分：压片显微镜检测法.pdf

ICS 65.020.30B 41Sc中华人民共和国水产行业标准SC/T 7202.1-2007斑节对虾杆状病毒病诊断规程第1部分：压片显微镜检查法Diagnostic Protocols for Penaeus monodon-Type Baculovirus(MBV) ofPenaeid Shrimp--Part 1: Microscopy Method with Wet Mount2007-06-14 发布2007-09-01实施中华人民共和国农业部发布 SC/T 7202. 1---2007前言SC/T 7202《斑节对虾杆状病毒病诊断规程》分为三个部分：-第1部分：压片显微镜检查法；一第2部分:PCR检测法；-第 3 部分:组织病理学诊断法。本部分为SC/T7202的第1部分。本部分的附录 A、附录 B为规范性附录。本部分由中华人民共和国农业部渔业局提出。本部分由全国水产标准化技术委员会归口。本部分起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站。本部分主要起草人：黄健、杨冰、陈爱平、宋晓玲、史成银、杨丛海、魏琦。I SC/T 7202.1—2007斑节对虾杆状病毒病诊断规程第1部分：压片显微镜检查法1 范围SC/T 7202的本部分规定了斑节对虾杆状病毒病压片显微镜检查法的原理、试剂与材料、仪器设备、操作步骤和结果判定。本部分适用于对虾活体及其粪便中的斑节对虾杆状病毒(MBV)核型多角体的检测,其中对粪便的检查可用于进行非致死性的疾病筛查和诊断。不适于对病毒非感染性携带的标本进行诊断,以及对宿主进行组织病理学评价。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。SC/T 7202.3—2007 斑节对虾杆状病毒病诊断规程第 3 部分:组织病理学诊断法3原理3.1 斑节对虾杆状病毒病的病原和病理学特征见 SC/T 7202.3--2007(斑节对虾杆状病毒病诊断规程‧第3部分:组织病理学诊断法)中 3.1 的规定。3.2通过光学显微镜观察新鲜组织样品或粪便中近球形的MBV核型多角体形成的情况，可初步诊断被检样品是否感染MBV。直接压片法是利用包涵体较高的折射率进行区分，孔雀石绿染色法是利用包涵体着色较深区分，压片焰红染色法是用荧光显微镜观察经焰红染料染色的包涵体激发出的荧光来判断。4试剂和材料4.1除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水。4.20.05%孔雀石绿染液按附录A的规定。4.30.001%焰红染液按附录A的规定。4.4自然海水经沉淀去除悬浮物。5仪器设备5.1显微镜：压片孔雀石绿染色法只需要普通明视野显微镜即可，直接压片法推荐使用相差显微镜，压片焰红染色法需要荧光显微镜（阻挡滤光片波长为520nm，激发滤光片波长为450nm～490nm)。5.2载玻片。5.3盖玻片。5.4 医用镊子。5.5解剖刀。5.6水族箱。1 SC/T 7202. 1--20075.7塑料虹吸管并接有一段塑料吸管尖头。5.8 玻璃试管。5.9吸水纸。6操作步骤6.1样品的准备6.1.1样品采集的要求见附录B。6.1.2组织样品：幼体取整体,仔虾取头胸部,幼虾和成虾取小块肝胰腺或小截中肠组织。6.1.3粪便样品：将幼虾或成虾暂养于水族箱中,待数小时直至水族箱底部出现粪便。用干净的塑料虹吸管吸取排泄物,注人玻璃试管中。6.2直接压片法将组织或粪便样品置于载玻片上，用解剖刀将样品切碎，盖上盖玻片，用明视野显微镜调小光圈观察,或用相差显微镜观察。6.3压片孔雀石绿染色法将组织或粪便样品置于载玻片上，用解剖刀将样品切碎，滴加1滴～2滴0.05%孔雀石绿染液，混匀，染色2min～4min，盖上盖玻片，用吸水纸吸取多余的液体,将制备好的压片置于明视野显微镜下观察。6.4压片焰红染色法将组织或粪便样品置于载玻片上，用解剖刀将样品切碎，滴加1滴～2滴0.001%焰红染液，混匀，染色2min～4min，盖上盖玻片，用吸水纸吸取多余的液体,将制备好的压片置于荧光显微镜下观察。7 结果判定7.1直接压片法：显微镜下可观察到受MBV感染的对虾肝胰腺或中肠的上皮细胞核肿大,核内有单个或多个折射率高的球形包涵体,单个包涵体直径约为0.1 μm～20 μm。受MBV 感染的对虾粪便压片可观察到带折光性的近似球形的包涵体，大小约20 μm，在新鲜粪便中，MBV包涵体常成团聚集，并被核膜包裹着。7.2压片孔雀石绿染色法可观察到包涵体着色发绿，与正常的细胞核、核仁、分泌颗粒或吞噬溶酶体和脂肪滴等其他球形体相比，包涵体着色