SN_T 1617-2017可可肿枝病毒检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1617—2017代替 SN/T 1617--2005可可肿枝病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Cacao swollen shoot virus2017-07-21 发布2018-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局刮涂层查真伪 SN/T 1617—2017前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草，本标准代替SN/T1617-2005《可可肿枝病毒检测方法》，与SN/T1617--2005相比，主要技术变化如下：完善了原标准的检测方法，增加实时荧光PCR检测方法；完善了原标准的基因组内容；删除了原标准中的免疫诱捕PCR方法，增加了PCR方法；修改了原标准中结果判断；修改了原标准中附录。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国中山出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本标准主要起草人：魏梅生、陈定虎、相宁、李桂芬、吴翠萍、郭京泽。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T 1617--2005。 SN/T 1617—2017可可肿枝病毒检疫鉴定方法1 范围本标准规定了可可肿枝病毒的检测方法本标准适用于进境植物材料中可可肿枝病毒的检疫检测。2可可肿枝病毒基本信息学名:Cacao swollen shootvirus缩写:CSSV中文名：可可肿枝病毒异名 : Theobroma virus l;Marmor theobromae ; Theobromavirus inflans 。分类地位：花椰菜花叶病毒科（Caulimoviridae）；杆菌状DNA病毒属（Badnavirus）。CSSV的其他信息参见附录 A。3　方法原理CSSV 的蛋白和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。根据 CSSV 与抗体之间的特异性反应,对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）；依据CSSV的基因组特征建立PCR、实时荧光PCR;通过这些方法的有效组合，判断样品是否带有 CSSV。4仪器、用具及试剂4.1仪器设备酶联检测仪、天平（感量0.001g）、PCR仪、电泳仪、实时荧光PCR仪、电泳槽、紫外透射仪、隔离温室、榨汁机、水浴锅等。4.2用具可调移液器（200 μL、20 μuL、2μL）、可调移液器头、酶联板、离心管、指型管、研钵等。4.3试剂酶联测定试剂（见附录B）、聚合酶链式反应检测试剂（见附录C）。5检测方法5.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定见附录 B。1 SN/T 1617—20175.2聚合酶链式反应(PCR)检测见附录 C。5.3实时荧光PCR检测见附录 D。5.4生物学测定参见附录 E。6结果判定样品检测流程及结果判定按下述原则进行。若DAS-ELISA检测结果为阳性时：PCR 的检测结果为阳性，则判定样品携带CSSV;或采用实时荧光PCR进行检测，若检测结果为阳性，则判定样品携带CSSV。若DAS-ELISA检测结果为阴性时：PCR的检测结果为阴性，则判定样品不携带 CSSV；检测结果为阳性，则对产物进行测序,测定的序列为 CSSV序列，则判定样品携带 CSSV。必要时可进行生物学传毒测定，并进行复验。7样品保存与复核7.1样品保存鉴于可可肿枝病毒为检疫性有害生物，,应做好以下准备，并在一周内接受复核病毒要有活体样品存在,其他样品应妥善保存于一80℃冰箱中，以备复核。7.2结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。生物学测定需有鉴别寄主的症状照片，酶联测定需有酶联板反应的照片和原始数据，PCR检测需有电泳结果照片，实时荧光PCR检测应有荧光曲线图。7.3复核由指定的单位或人员负责。主要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。2 SN/T 1617—2017附录A（资料性附录）可可肿枝病毒其他信息A.1 寄主范围重要的自然寄主有可可（Theobroma cacao）、厚皮可乐果（Cola chlamydantha）、吉贝（Ceiba pentandra）大可乐果变近无毛变种（Cola gigantean var.glabrescens）和种苹婆属植物 Sterculia traga-cantha。人工接种还可侵染木棉科（Bombacaceae）、機树科（Tiliaciae）、梧桐科（Sterculiaceae）、锦葵科（Malvaceae)等 30 种植物，其中猴面包树（Adansnia digit