SN_T 3567.6-2015交叉引物恒温扩增检测方法 第6部分：结核分枝杆菌.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3567.6—2015交叉引物恒温扩增检测方法第6部分：结核分枝杆菌Detection method of crossing priming isothermal amplification-Part 6:Mycobacterium tuberculosis2016-07-01实施2015-12-04发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T3567.6-2015前言SN/T3567《交叉引物恒温扩增检测方法》分为以下几个部分：第1部分：通用技术规程；第2部分：霍乱弧菌；第3部分：大肠杆菌0157:H7；-第4部分：黄热病毒；第5部分：沙门菌属；第6部分：结核分枝杆菌；....本部分为SN/T3567的第6部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、杭州优思达生物技术有限公司。本部分主要起草人：祁军、左锋、詹曦菁、王馨、牛国宇、尤其敏、胡林。I SN/T3567.6—2015交叉引物恒温扩增检测方法第6部分：结核分枝杆菌1范围SN/T3567的本部分规定了在国境口岸采用交叉引物恒温扩增法检测结核分枝杆菌的生物安全措施、检测对象、试剂和材料、仪器设备及检测程序，本部分适用于在国境口岸对人型结核分枝杆菌和牛型结核分枝杆菌的筛选检测，以及对国境口岸出入境人员感染结核分枝杆菌的实验室快速检测2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件，GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求SN/T3567.1交叉引物恒温扩增检测方法第1部分：通用技术规程WS288肺结核诊断标准人间传染的病原微生物名录（2006）3术语和定义SN/T3567.1界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1结核分枝杆菌MycobacteriumtuberculosisTB俗称结核杆菌，其主要致病种类为人型及牛型结核杆菌，是引起结核病的病原菌。结核病可侵犯全身各器官，但以肺结核最为常见。结核病仍为国际最常见的传染病之一。4生物安全措施实验操作及处理按照GB19489和《人间传染的病原微生物名录》（2006）的规定，由具备相关资格的工作人员进行。5检测对象5.1疑似人型、牛型结核分枝杆菌的待检菌株。5.2结核分枝杆菌感染或疑似结核分枝杆菌感染的痰标本。6试剂和材料除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化试剂，包括：1 SN/T 3567.6—2015按照GB/T6682规定的一级水。-DNA提取液：5%Chelex水溶液或细菌基因组DNA提取试剂盒。-10×ThermoPol缓冲液。-10mmol/LdNTPs溶液：dATP，dTTP,dCTP,dGTP各2.5mmol/L。-Bst DNA 聚合酶：8 U/μL。-甜菜碱溶液：5mol/L。硫酸镁溶液：1-mol/L。-阳性对照：含有目的片段的质粒DNA。引物：交叉扩增引物、剥离引物和检测引物。7仪器设备所用仪器设备如下：任何恒温装置，如：水浴锅、金属浴或普通PCR仪。微量移液器：量程范围为0.5μL～10μL、10μL～100μL、100μL～1000μL。计时器。超净工作台。生物安全柜。一消毒灭菌锅。高速台式离心机（最高离心力12000g以上）。台式离心机（最高离心力2000g以上）。涡旋振荡器。低温冰箱、冷冻冷藏冰箱。8结核分枝杆菌交叉引物恒温扩增法检测程序8.1样本标识样本应进行唯一性标识。8.2样本采集、细菌增菌及分离鉴定按照WS288执行。8.3样本前处理8.3.1平板上纯培养物用无菌接种环从平板上挑取1/4个～1个纯菌落，混悬于1mL灭菌或无菌双蒸水或纯水中大于10000g离心10min，保留沉淀物，备用。8.3.2痰液样本岁痰液液化取约5mL痰液中加人1倍～2倍体积的4%NaOH溶液，涡旋振荡器振荡混匀，室温下放置20min～30min，使其充分液化（无明显固状物且吸出时无拖丝现象，若未达到完全液化可适当加人少量4%的NaOH溶液直至液化完全）。2 SN/T3567.620洗涤取1mL液化后痰液至1.5mL离心管，14000g离心10min，尽可能完全倾倒上清，倾倒后剩余的少量液体需要用移液器吸净（注意不要碰触到沉淀物）；沉淀用1mL生理盐水（质量浓度为0.9%的NaCI)悬浮，同上离心条件洗涤2次。保留沉淀物，备用。8.4模板DNA提取8.4.1加热煮沸法提取取上述沉淀物，向其中加人DNA提取