SN_T 4781-2017出口食品和饲料中产志贺毒素大肠埃希氏菌检测方法 实时荧光PCR法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4781—2017出口食品和饲料中产志贺毒素大肠实时荧光PCR法埃希氏菌检测方法Detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli in food andanimal feed for exportsReal-time PCR method2017-12-01实施2017-05-12发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局O SN/T4781—2017前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局。本标准主要起草人：邵景东、申进玲、封振、王传现、薛峰、郭旸、吴福平、王毅谦、李晓红、祝长青、肖震、崔思宇。 SN/T4781—2017出口食品和饲料中产志贺毒素大肠埃希氏菌检测方法实时荧光PCR法1范围菌的实时荧光PCR快速检测方法本标准规定了出口食品和饲料本标准适用于出口食品和饲料中产志贺毒素大肠埃希氏菌（0157、0104、0111、O26、O0145和0103)的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括房所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范3术语和定义下列术语和定义适用于3.1产志贺毒素大肠埃希氏菌higa toxin-producing Escherichia coli;STEC肠埃希氏菌含有志贺毒素编码基因3.2Shiga toxin-producing Escherichia coli causing the attaching and肠出血性大肠埃希氏菌effacing lesion同时含有志贺毒素编码基因str和紧密素编码基因eae的大肠埃希氏菌。注：这种毒力基因组合常与STEC所引起的严重疾病相关。3.3实时荧光PCRrealtimePCR在PCR反应体系中加人荧光集团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。3.4Ct值cyclethreshold每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。4方法提要对样品中微生物进行增菌培养后提取核酸，采用实时荧光PCR方法对志贺毒素编码基因str和紧密素编码基因eae进行检测。若样品中str阳性，继续进行菌株分离；若sta和eae阳性，继续进行O血1 SN/T4781—2017清组编码基因rfbE（O157）、wzx（O104）、wbdl（O111）、wzr（O26）、ihp1（O145）和wzz（O103）的检测。若检测到以上某种O血清组阳性，可先对特异的O血清组菌株富集再进行菌株分离。5培养基和试剂除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。5.1改良胰蛋白陈大豆肉汤（mTSB)：见附录A中A.1。5.2缓冲蛋白陈水（BPW）：见A.2。5.3CHROMagarSTEC显色培养基：见A.3。5.4CHROMagarO157显色培养基：见A.4。5.5改良山梨醇麦康凯（CT-SMAC)琼脂：见A.5。5.6三糖铁琼脂（TSI)：见A.6。5.7TE溶液。5.810%SDS。5.9蛋白酶K（20mg/mL）。5.10氯化钠（NaCl)：5mol/L和0.7mol/L。5.1110% CTAB。5.12三氯甲烷。5.13异戊醇。5.14异丙醇。5.1570%乙醇。5.16核酸提取试剂盒。5.17PCR预混液。5.18引物和探针：见附录B。5.19诊断分型血清：0157、0104、0111、026、0145和0103混合多价或单因子血清5.20API20E生化鉴定试剂条或同类产品。5.21GNI+卡或同类产品。5.22标记单抗磁珠：抗一0157/0104/0111/026/0145/0103免疫磁珠试剂或同类产品。66仪器和设备6.1恒温水浴或加热套装置：100℃。6.2恒温培养箱：36℃±1℃。6.37离心机：最大转速13000r/min以上。6.4天平：量程2kg，感量0.1g。6.5低温冰箱：-20℃~4℃。6.6均质器。6.7涂布棒：直径3mm~4mm。6.8接种环：直径3mm。6.9灭菌样品处理器具：取样勺、剪刀、镊子。2 SN/T 4781—20176.10可调移液器：1μL~1000μL。6.11实时PCR反应管（0.2/0.5mL），多孔PCR微孔板。6.12荧光PCR仪。6.13全自动细菌鉴定系统（VITEK或同类仪器