SN 1317-2003痒病组织病理学检查方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1317—2003痒病组织病理学检查方法Protocal of histopathological diagnosis for scrapie2004-02-01实施2003-08-18 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1317-2003前言本标准的附录 A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：马贵平、李冰玲、刘艳华。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。人 SN/T 1317—2003痒病组织病理学检查方法1 范围本标准规定了羊痒病脑组织病理学检查方法。本标准适用于羊痒病脑组织病理学诊断。2 引用标准下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验用水规格和实验方法3材料3.1被检组织羊脑组织。3. 2 试剂3.2.110%中性福尔马林。3.2.2 96%甲酸。3.2.3无水乙醇、70%乙醇溶液、80%乙醇溶液、95%乙醇溶液。3.2.4 二甲苯。石蜡(熔点为52℃～54℃,54℃～56℃,56℃～~58℃)。3.2.5苏木素染色液（见第A.1章）。3.2.6盐酸乙醇：100mL70%乙醇溶液+1mL盐酸。3.2.7二级水（符合GB/T6682）。3.2.8伊红染液（见第A.2章）。3.2. 9无水乙醇：二甲苯(1：1)溶液。.11封片剂：甘油乙烯乙醇溶液。1%过氧化氢甲醇溶液。3.2. 123.2. 13胰酶溶液。3.2.14ABC 试剂盒。AEC 试剂盒。3.2.15PrP单克隆抗体。3.2. 16PBS(pH7. 0,0. 15 mol/L).3.2. 173.3仪器设备3.3.1自动脱水浸蜡机。3.3.2包埋台。切片机。.4展片槽。3.3.5烘干台。3.3.6自动染色机。 SN/T 1317—-20033.3.7封片机。3.3.8显微镜。3.3.9脱水包埋盒。3.3.10包埋模具。3. 3. 11载玻片、盖玻片（按常规方法处理）。4　方法4.1羊脑组织的固定将取得的新鲜羊脑组织浸人到10倍～20倍的10%中性福尔马林溶液中固定。一周后更换固定液。为了缩短固定脑组织的时间，可在三级生物安全实验室或二级生物实验室中的三级生物安全柜中，在被检羊脑组织上分别切取一定厚度(一般为 2 mm～3mm)的脑组织,装人脱水包埋盒中，放人 10%中性福尔马林溶液中固定。一般 2 d～3 d即可。脑干区域切取可按图1进行。a）背面b）侧面R建议切取的水平部位：A-A=延髓脑闫部位;B-B=延髓 小脑后脚部位;C-C=中脑前丘部位。图1 切除小脑的脑干4.2去除感染性将盛有羊脑组织的脱水包埋盒移至96%甲酸中至少浸泡1h后,用自来水冲洗。4.3制备脑组织切片4.3.1 组织脱水、浸蜡将处理后的组织(在脱水包埋盒中)放人自动脱水浸蜡机中，进行脱水浸蜡［70%乙醇2h、80%乙醇1h、95%乙醇1.5h、100%乙醇1h、100%乙醇1.5h、100%乙醇2h、100%乙醇：二甲苯(1：1)1h、二甲苯1 h、二甲苯2 h、二甲苯2 h;溶点为52℃～54℃、54℃～56℃和56℃～58℃石蜡中分别浸泡2 h、2h和1hl。4.3.2石蜡包埋浸蜡后，使用包埋机进行常规石蜡包埋。待石蜡完全冷却后，将模具与冷却的石蜡块分开。将制备好的组织石蜡包埋块放到4℃冰箱中待用。4.3.3切片、展片切片：将制备好的脑组织石蜡包埋块固定到切片机上，调整切片厚度为5μm，匀速转动切片机手柄切片。展片：将展片槽中的水加热到37℃～45℃，把切出的石蜡包埋组织轻轻的移人展片槽中。烘于：用处理好的载玻片将组织捞出，使之黏附于玻片的适当位置。将粘贴有石蜡包埋组织2 SN/T 1317—2003的载玻片放到烘干台（50℃)上，烘干(30min）。也可在37℃温箱中过夜干燥。干燥后的组织切片在室温下保存，待检4. 4伊红-苏木素溶液(H.E)染色步骤4.4.1二甲苯;10 min。4.4.2二甲苯:10 min。4.4.3二甲苯：无水乙醇(1：1)溶液:2 min～5 min。4.4.4无水乙醇:2 min～5 min。4.4.5无水乙醇:2 min～5 min。4.4.6 95%乙醇:2 min~5 min。4.4.7 80%乙醇:2 min~5 min。4.4.870%乙醇:2 min～5 min。4.4.9二级水:2 min～5 min。4.4. 10苏木素染色液:3min(可