SN_T 1618-2017李属坏死环斑病毒检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T替SN/T1618—2005李属坏死环斑病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Prunus necrotic ringspot virus2017-07-21 发布2018-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1618—2017前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1618-2005《李属坏死环斑病毒检测方法》。本标准与SN/T1618--2005相比，主要技术变化如下：增加了实时荧光RT-PCR检测方法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：李桂芬、魏梅生、张永江、马洁、孔君。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T 1618--2005。 SN/T 1618—2017李属坏死环斑病毒检疫鉴定方法1范围本标准规定了植物检疫中李属坏死环斑病毒检疫鉴定方法。本标准适用于植物材料中李属坏死环斑病毒的检疫鉴定。2 基本信息学名: Prunus necrotic ringspot virus缩写:PNRSV分类地位：雀麦花叶病毒科（Bromouirus），等轴不稳环斑病毒属（Ilarvirus）。该病毒的其他信息参见附录 A。3方法原理根据李属坏死环斑病毒与抗体之间的特异性反应,对植物样品进行ELISA检测；根据该病毒核酸序列进行PCR特异性检测，通过电泳条带大小进行结果判定；根据该病毒核酸序列设计特异性引物和荧光探针，通过检测荧光信号进行结果判定。41仪器设备及试剂4.1仪器设备酶标仪、天平（感量，1/10 000 g）、pH计、PCR 仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、隔离温室、恒温水浴、低温冰箱等。微量移液器(2 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1000 μL）、酶联板、研钵、离心管、花盆、消毒土等。4.2试剂酶联免疫吸附测定试剂见附录 B中B.1,RT-PCR检测试剂见附录 C中C.1,实时荧光 RT-PCR检测试剂见附录 D中 D.1。5样品制备木本寄主植物选其幼叶、果肉组织和花，草本植物选其叶子。有症状的样品编号单独检测，没有症状的样品分组（10～15为1组)并编号检测。6检测方法6.1酶联免疫吸附测定见附录 B。A SN/T 1618-20176.2 RT-PCR 检测见附录 C。6.3实时荧光 RT-PCR检测见附录 D。7结果判定样品检测时，检测流程及结果判定按下述原则进行：首先采用DAS-ELISA进行初步筛检。若DAS-ELISA检测结果为阳性时，RT-PCR的检测结果为阳性，则判定样品携带 PNRSV或采用实时荧光 RT-PCR进行检测，若检测结果为阳性，则判定样品携带 PNRSV。-若DAS-ELISA检测结果为阴性时，RT-PCR的检测结果为阴性，则判定样品不携带 PNRSV;检测结果为阳性，则对产物进行测序，测定的序列为 PNRSV序列，则判定样品携带 PNRSV。8　样品保存经检测确定携带李属坏死环斑病毒的样品（叶片、花、果实）一80℃保存一年，做好标记和登记工作。9结果记录与资料保存完整的记录包括：样品的来源、时间、地点、方法和结果等并要有经手人和实验人员的签字。酶联测定需有酶联板反应的原始数据，RT-PCR检测需有电泳结果图片，实时荧光RT-PCR检测需要有反应原始数据。2 SN/T 1618-2017附录A（资料性附录）李属坏死环斑病毒背景资料A.1寄主范围李属坏死环斑病毒病寄主范围十分广泛，自然和人工条件下，病毒可侵染的寄主达21科双子叶植物，其中可侵染的木本植物有：李属的欧洲李（Prunus domestica）、桃属的桃（Amygdalus persica）、樱属的欧洲甜樱桃（Cerasus avium）、樱属的欧洲酸樱桃（Cerusus vulgaris）、杏属的杏（Armeniaca vul-garis）、苹果属的苹果（Malus pumila）、蔷薇属的月季花（Rosa chinensis）、悬钩子属的椭圆悬钩子（Ru-bus ellipticus）、秋海棠属的秋海棠（Begonia grandis）；侵染的草本植物有啤酒花（Humulus lupulus）、烟草（Nicotianu tabacum）、西瓜（Citrullus lanatus）、南瓜（Cucurbita moschata）、甜瓜（Cucumismelo）、西葫芦(Cucurbita pepo）、菜豆（Phaseolus vulgaris）、豌豆（Pisum sativum）、豇豆（Vigna unguiculata）、草木犀（M