SN_T 4652.3-2016国境口岸寨卡病毒病防控技术规范 第3部分：实验室检测.pdf

ICS 11.020C 5：..中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4652.3--2016国境口岸寨卡病毒病防控技术规范第3部分：实验室检测Technical specification for Zika virus disease prevention and controlat point of entry--Part 3:Laboratory detecting methods2016-08-23 发布2017-03-01 实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4652.3—2016前言SN/T4652《国境口岸寨卡病毒病防控技术规范》分为3个部分：第1部分：疫情监测规程；第2部分：标本采集和处理方法；-第3部分：实验室检测。本部分为SN/T4652的第3部分。本部分按照GB/T 1.1--2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口本部分起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国河北出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本部分主要起草人：李小波、黄吉城、戴俊、袁帅、聂维忠、郑夔、闫冀焕、刘春晓、毕英杰、顾大勇。 SN/T 4652.3--2016国境口岸寨卡病毒病防控技术规范第3部分：实验室检测1范围SN/T4652的本部分适用于国境口岸人出境人员感染或蚊类携带寨卡病毒的实验室检测、结果判定、报告及相关生物安全要求，检测方法包括核酸检测、细胞培养、乳鼠接种等。本部分适用于国境口岸人出境人员感染或蚊类携带寨卡病毒的实验室检测2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版)适用于本文件。GB19489实验室　生物安全通用要求SN/T4652.2病原微生物实验室生物安全管理条例［国务院令（第424号）】寨卡病毒防控方案（第二版）（国卫办疾控函（2016)311号）3缩略语下列缩略语适用于本文件。Ct 值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数；（Cycle threshold)MEM:最低必须培养基；(Minimum essential medium)FAM:FAM荧光染料，-种荧光报告基团。（6-carboxy-fluorescein）标本的采集、运输和保存4标本类型包括人血样、尿样、睡液、精液等及蚊类标本，标本的采集、运输和保存按SN/T4652.2进行。5标本的前处理标本的前处理按 SN/T 4652.2进行。6实验室生物安全要求《寨卡病毒病防控方案》第二版)规定，寨卡病毒在我国归属于三类病原体，应在生物安全二级实验室(BSL-2)开展实验室检测。应按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》等相关规定要求，做好生物安全防护工作。1 SN/T 4652.3--20167寨卡病毒核酸分子生物学检测利用实时荧光 RT-PCR法检测寨卡病毒核酸（双靶标基因检测），同时建立寨卡病毒核酸普通 RTPCR检测方法（双靶标基因检测），对特异性扩增产物进行电泳分析，以判断标本中是否含有寨卡病毒核酸。7.1实时荧光 RT-PCR 检测7.1.1原理实时荧光 RT-PCR方法有多种,本标准采用的是 TaqMan 水解探针法，其原理是在常规 RT-PCR的基础上，加人一条特异性的荧光探针，该探针为一段寡核苷酸，两端分别标记一个报告基团和一个灭荧光基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，利用Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切水解，使报告荧光基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步。每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，用Ct值表示。7.1.2设备需要如下仪器设备：荧光定量PCR仪；生物安全柜；普通冰箱；-70℃超低温冰箱;；普通台式离心机；高速冷冻离心机（转速可达20000g）；涡旋器;-冷冻振荡组织研磨器。7.1.3试剂需要如下试剂：市售商品化核酸提取试剂如QIAamp Viral RNA Kit1’；市售商品化步法荧光 RT-PCR试剂如 Ag-Path-IDTM One step RT-PCR Kit’；无RNA酶水。7.1.4引物和探针序列　第一套引物及探针ZIKVup: 5-GTGACGCCACCATGAGCTATGA-3;ZIKVdp: 5′-TGATGGCAGGTTCCGTACACAAC-3;ZIKVPr0:5FAM-CCAAGTTGACGTCGTGTTGCACCAGCA-BHQ1-3。1）非商业声明：由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本部分的使用者，并不表示对该产品的