SN_T 1207-2011猪痢疾检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1207—2011代替SN/T1207—2003猪痫疾检疫技术规范Quarantine protocol for swine dysentery2011-05-31发布2011-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1207—2011前言本标准按照GB/T 1.1--2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1207-—2003《猪痫疾短螺旋体分离培养操作规程》。本标准与SN/T1207-2003相比，主要技术变化如下：一增加了猪痫疾临床诊断及疾病概述相关技术内容；-增加了患病猪大肠组织切片镜检操作方法内容；修改、完善了猪痫疾短螺旋体分离培养和鉴定方法，细化了采样方法与检测程序；-增加了猪痫疾短螺旋体的 PCR检测鉴定方法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国湖北出人境检验检疫局、华中农业大学。本标准主要起草人：陈建军、郭明星、曾宪东、金梅林、张四喜、黄晟、冯汉利、赵晖、徐家文、张春亚。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-SN/T 1207—2003。 SN/T 1207--2011猪痫疾检疫技术规范1范围本标准规定了猪痫疾病的临床诊断、组织切片镜检及猪痫疾短螺旋体分离培养和鉴定方法。本标准适用于猪疾病的检疫诊断。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682　分析实验室用水规格和试验方法GB 19489实验室生物安全通用要求GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。SD(swine dysentery):猪痫疾B. h(brachyspira hyodysenteriae):猪痢疾短螺旋体B.i(brachyspira innocens）：非致病性短螺旋体B.p(brachyspira pilosicoli):结肠菌毛样短螺旋体4临床诊断猪只感染 SD后所表现出的临床、病理症状大多较为典型,对于本病的检疫可结合猪群的流行病学、临床症状及病理解剖检验的结果对猪只是否感染本病作出初步的诊断，具体方法参见附录 A。5 实验室诊断5.1大肠组织切片镜检5.1.1材料准备器材：组织切片机、生物显微镜、染色缸、水浴锅、恒温培养箱、载玻片。试剂：10%福尔马林、70%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、二甲苯、切片石蜡、革兰氏染色液或姬姆萨染色液。5.1.2样品采集与处理剖检病猪,取病变大肠段(盲肠、结肠和直肠前段）,冷藏送检。切取1cm²左右病变大肠段样品置10%福尔马林中至少固定3h～4 h。1 SN/T 1207—20取出样品用流水冲洗1 h。将样品依次浸人39℃的95%乙醇、无水乙醇中，各脱水30 min。再将脱水后的样品浸人 38 ℃的二甲苯中,透明 10 min～15 min。取透明样品依次浸人56℃的二甲苯石蜡（体积比=1：1)10 min、二甲苯石蜡（体积比一1：3)20 min 和液体石蜡中 30 min～60 min,进行浸蜡包埋。用切片机切片，并将组织切片贴于洁净载玻片上，置56℃温箱2h～3h或38℃温箱中过夜烘干，备染。取烘干切片样品依次浸入两缸二甲苯中脱蜡，各 3min～5 min。再依次放入无水酒精、95%和70%酒精中浸泡2min～3min，取出用流水润洗。0用革兰氏染色液染色，干燥，再用二甲苯透明一次，用盖玻片封片备检。或以10倍稀释的姬姆萨染色液浸染脱蜡切片样品8h124h再迅速通过两缸无水乙醇，千燥，二甲苯透明，封片备检。5.1.3镜检镜检观察,SD 阳性病猪病料可在粘膜表面特别是在结肠腺窝内见到大量的 B.h样菌体,B.h为革兰氏阴性，长 6 μm～8.5 μm,，呈舒展的2～4 个螺旋状，两端发锐的蛇样菌（参见附录 B)。5.2猪痢疾短螺旋体的分离培养和鉴定5.2.1材料准备器材：生物显微镜、载玻厌氧培养箱（罐）（20%CO、80°@H²）、离心机、灭菌注射器、手术刀、止血钳、缝合针、线、灭菌棉拭子试剂:BJ培养基、磷酸缓冲液(091 mol/LrPH7.2 PIS)(配制方法见附录 C)、革兰氏染色液或姬姆萨染色液。kg)或豚鼠(3周龄～4周龄)或幼小鼠（20g左右）。　试验动物：仔猪（15 kg~5.2.2病料采集处理与分离培养样品，置人袋有适量PBS的灭菌试管内，密封后0℃～4℃保存送采集直肠或新鲜粪便找检，3d内进行分离培养检验；对干病死瘀或排杀猪，可将大肠（盲肠、结肠及直肠前段)分段两头结扎（每段10cm），分离取出，样品置℃谋存箱尽快送检，进行镜检及病原分离培养，样品保存不超过5 d~7 d。