SN_T 4611-2016国境口岸斑点热群立克次体巢式PCR检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4611—2016国境口岸斑点热群立克次体巢式PCR检测方法Nested PCR detecting method for spotted fever grouprickettsiae at frontier port2016-08-23 发布2017-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局查真伪 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准国境口岸斑点热群立克次体巢式 PCR 检测方法SN/T 4611---2016*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045)总编室：（010址 中国标准出版社秦皇岛印刷广印刷*印张0.5　字数 10千字开本 880×1230 1/162017年11月第一版　2017年11月第一次印刷印数 1-500*书号：155066·2-32308 SN/T 4611—2016前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、中华人民共和国河北出人境检验检疫局、军事医学科学院微生物流行病研究所。本标准主要起草人：鞠文东、王艳梅、丁淑丽、程成、闫冀焕、徐宁、付维明、耿聪、孙毅、包力。 SN/T境口岸斑点热群立克次体巢式 PCR 检测方法1范围本标准规定了国境口岸斑点热群立克次体的检验对象、方法、生物安全要求及结果判定。本标准适用于国境口岸人、医学媒介生物（蜱、螨等）以及宿主动物中斑点热群立克次体的巢式PCR方法检测(除外 R.helvetica、R.australis、R.bellii、R.canadensis 4 种立克次体）。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489　实验室　生物安全通用要求SN/T1193基因检验实验室技术要求WS/T 230　临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1斑点热群立克次体spotted fever group rickettsiae;SFGR引起斑点热的一组病原体，可引起包括落矶山斑点热、钮扣热、北亚热、昆士兰斑点热、立克次体痘和日本红斑热在内的多种疾病，是天然寄生在螨和蜱体内并通过螨和蜱的叮咬传播给人或动物的专性细胞性寄生菌。除个别的立克次体为螨传播外，其余均为蜱传播，具有明显的自然疫源性特征。主要媒介蜱包括：草原革蜱、边缘革蜱、森林革蜱、中华革蜱、嗜群血蜱、日本血蜱、长角血蜱、亚洲璃眼蜱。4检测对象4.1疑似感染斑点热群立克次体的受染嫌疑人的血液样本。4.2从出人境交通工具、集装箱及口岸地区等场所采集的疑似感染斑点热群立克次体的游离蜱及以上述场所宿主动物体表采集的寄生蜱。4.3出人境交通工具、集装箱及口岸地区等场所捕获的疑似感染斑点热群立克次体的宿主动物。5生物安全和 PCR防污染要求5.1检测工作中的个人防护参照GB19489执行。5.2进行标本检测的实验室应符合GB19489生物安全二级实验室要求。5.3使用过的实验用品应按照GB19489规定对废弃物的处理要求进行无害化处理。1 SN/T 4611-20165.4　PCR防污染措施按照WS/T230和SN/T1193的规定执行。仪器和耗材6 本方法使用的主要仪器和设备如下：扩增仪；生物安全柜；高速台式离心机（最高离心力12000g以上）；台式离心机（最高离心力2000g以上）；漩涡振荡器；恒温水浴锅；高压灭菌锅；-低温冷藏、冷冻冰箱；微量可调移液器（10uL、100ul、200uL、1000uL）及配套带滤芯吸头；Eppendorf 管;螺口塑料管。7主要试剂7.1除另有规定外，所有化学试剂均采用分析纯，实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。7.2核酸提取试剂：天根生化科技（北京)有限公司生产的细菌核酸提取试剂盒1）。7.3PCR反应试剂如下10XPCR缓冲液（Mg²+plus),a）b) dNTP(10 mmol/L);Taq 酶(5 U/μL);c）d）阴性对照品（灭菌双蒸水 ddH,O);e）阳性对照品（阳性的斑点热群立克次体）。以上试剂也可由商品化试剂盒提供7.4电泳缓冲液(10XTBE)制备方法如下：称取 108 g Tris 碱,7.44g Na²EDTA·H,O和 55g 硼酸,溶手800 mL的 ddH²O 中,充分搅