NY_T 1432-2014玉米品种鉴定技术规程 SSR分子标记法.pdf

ICS 65.020.20B 05NY中华人民共和国农业行业标准NY/T1432—2014代替NY/T1432—2007玉米品种鉴定技术规程SSR标记法Protocol for the identification of maize varieties-SSR marker method2014-03-24发布2014-06-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T1432—2014目次前言范围2规范性引用文件3术语和定义原理5仪器设备及试剂6溶液配制7引物信息8.参照品种信息9操作程序10数据记录与统计11判定规则附录A（规范性附录）主要仪器设备及试剂..附录B(规范性附录）溶液配制.附录C(规范性附录)核心引物名单及序列附录D(资料性附录)核心引物相关信息1附录E(资料性附录)参照品种名单及来源附录F(规范性附录)数据统计记录表 NY/T 1432—2014前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任，本标准为NY/T1432--2007《玉米品种鉴定DNA指纹方法》的修订版，在品种鉴定过程中参考使用。本标准代替NY/T1432—2007。本标准与NY/T1432—2007相比.除编辑性修改外主要技术变化如下：增加了荧光标记毛细管电泳检测（见9.4.2）；增加了特定标记的检测（见9.3.1）；增加了资料性附录核心引物相关信息、参照品种名单及来源以及规范性附录数据统计记录表（见附录D、附录E）。本标准由农业部种子管理局提出。本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/TC277）归口。本标准起草单位：北京市农林科学院玉米研究中心、农业部科技发展中心-本标准主要起草人：王凤格、易红梅、赵久然、刘平、张新明、田红丽、堵苑苑，本标准历次版本发布情况为：-NY/T1432—2007。I NY/T1432—2014玉米品种鉴定技术规程SSR标记法1范围本标准规定了利用简单重复序列（Simplesequencerepeat.SSR）标记法进行玉米（ZeumuysL.）品种鉴定的操作程序、数据记录与统计、判定规则。本标准适用于玉米自交系和单交种的SSR指纹数据采集及品种鉴定.其他杂交种类型及群体和开放授粉品种可参考本标准。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件.仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682中国实验室用水国家标准3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1核心引物coreprimer品种鉴定中优先选用的一套SSR引物，具有多态性高、重复性好等综合特性。3. 2参照品种referencevariety具有所用SSR位点上不同等位变异的品种。参照品种用于辅助确定待测样品的等位变异，校正仪器设备的系统误差。4原理由于不同玉米品种遗传组成不同，基因组DNA中简单重复序列的重复次数存在差异，这种差异可通过PCR扩增及电泳方法进行检测，从而能够区分不同玉米品种5仪器设备及试剂见附录A。6溶液配制见附录B。7引物信息核心引物名单及序列见附录C，核心引物等位变异等相关信息参见附录D。8老参照品种信息参见附录E。99操作程序9.1样品制备1 NY/T1432—2014送验样品可为种子、幼苗、叶片、苞叶、果穗等组织或器官。对玉米自交系和单交种，随机数取至少20个个体组成的混合样品进行分析，或直接对至少5个个体单独进行分析；对于其他杂交种类型，随机数取至少20个个体单独进行分析。9.2DNA提取CTAB提取法：幼苗或叶片200mg～300mg.置于2.0ml离心管，加液氮充分研磨，或取种子充分磨碎.移入2.0ml.离心管；每管加人700ul.65℃预热的CTAB提取液后，充分混合，65℃保温60min，期间多次颠倒混匀；每管加入等体积的三氯甲烷/异戊醇混合液，充分混合后.静置10min；12000g离心15min后.吸取上清液至一新离心管.再加入等体积预冷的异丙醇.颠倒离心管数次，在一20℃放置30min；4℃.12000g离心10min.弃上清液；加人70%乙醇，旋转离心管数次，弃去乙醇；将离心管倒立于垫有滤纸的实验台上，室温干燥沉淀6h以上；加人100μl.超纯水或TE缓冲液.充分溶解后备用，SDS提取法：剥取干种子的胚.放入1.5mI离心管中.加入100uI，氯仿后研磨，加入300u，SDA提取液.混匀后于10000g离心2min，吸上清液加人预先装有300ul异丙醇和300ul,NaC1溶液的1.5ml.离心管中.待DNA成团后挑出.经70%乙醇洗涤后加入200ulTE缓冲液.待充分溶解后备用。试剂盒提取法：使用经验证适合SSR指纹技术的