SC_T 7211-2011传染性脾肾坏死病毒检测方法.pdf

ICS 11.220EB 41Sc中华人民共和国水产行业标准SC/T 7211—2011传染性脾肾坏死病毒检测方法Detection method of infectious spleen and kidney necrosis virus2011-09-01发布2011-12~01 实施中华人民共和国农业部-、发布 SC/T言本标准按GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部渔业局提出。本标准由中华人民共和国农业部全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。本标准起草单位：中国水产科学研究院珠江水产研究所、中山大学。本标准主要起草人：潘厚军、何建国、吴淑勤、翁少萍、董传甫、付小哲、石存斌 SC/T染性脾肾坏死病毒检测方法1范围本标准规定了采用间接荧光抗体技术(IFAT)和聚合酶链式反应技术（PCR)检测传染性脾肾坏死病毒（ISKNV)的方法。本标准适应于传染性脾肾坏死病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。本标准可检测包含ISKNV在内的肿大细胞病毒属病毒，包括真鲷虹彩病毒(RSIV)、条石鲷虹彩病毒(RBIV)、斜带石斑鱼虹彩病毒(OSGIV)等；但不能检测虹彩病毒科其他属病毒。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样SC/T7014水生动物检疫实验技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1传染性脾肾坏死病毒ISKNV,infectious spleen and kidney necrosis virus传染性脾肾坏死病毒是虹彩病毒科肿大细胞病毒属的代表种。该病毒为一种胞质型双链DNA病毒，呈二十面体对称结构，病毒颗粒直径约150nm，基因组大小111032bp。该病毒感染敏感细胞，可引起一定程度的皱缩、坏死等细胞病变（CPE)；感染和多种海、淡水养殖鱼类，引起脾脏和肾脏肿大、坏死，鳃发白、呈缺血状的淡红色，肝脏苍白等症状。该病毒的主衣壳蛋白（MCP，majorcapsid protein）是高丰度结构蛋白，约占ISKNV蛋白总量的40%。虹彩病毒MCP基因具有高度的保守性，是虹彩病毒进行系统分类的主要依据。MCP基因也是对虹彩病毒进行分子诊断的常用靶基因。4试剂和材料4.1水符合GB/T6682中一级水的要求。4.2ISKNV参考株和ISKNV的DNA由有资质的动物病原微生物菌（毒）种保藏机构提供。4.3敏感细胞株仔鱼细胞系（MFF-1)或其他敏感细胞系、株，由有资质的实验室提供。4.4Mab(2D8)抗ISKNV单克隆抗体，由有资质的实验室提供，20℃保存。4.5FITC标记的羊抗鼠IgG商品化试剂，一20℃保存。一 SC/T 7211—20114.6基因组 DNA提取试剂盒商品化试剂盒，按说明书要求保存。4.7Taq酶一20℃保存，避免温度剧烈变化。4.8dNTP一20℃保存,含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L。4.9引物-20℃保存。其序列如下：上游引物F：5-CGTGAGACCGTGCGTAGT-3；下游引物R：5AGGGTGACGGTCGATATG-3。使用时浓度均为20μmoL/L。4.10DNA分子量标准(Marker)推荐使用DL2000，各片段大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。也可使用DNAladder100，各片段大小依次为1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300 bp、200 bp和 100 bp。4.11核酸凝胶染色剂溴化乙啶(EB)或其他EB替代品。4.12甲醇分析纯试剂，使用前预冷到一20℃。4.13无水乙醇分析纯试剂。4.14其他试剂见附录A。5仪器、设备和器材5.1倒置显微镜、荧光显微镜或倒置荧光显微镜。5.2生化培养箱。5.3普通冰箱和超低温冰箱。5.4PCR扩增仪。5.55离心机和离心管。5.6电泳仪和水平电泳槽。5.7紫外观察灯或凝胶成像仪。5.8组织研磨器。5.9漩涡振荡器。5.1024孔、6孔细胞培养板和25cm²细胞培养瓶。5.11微量移液器及吸头。5.12剪刀、镊子、解剖刀等解剖用具。5.13载玻片、盖玻片。5.14湿盒。6样品来源6.1采样按GB/T18088的规定执行。如是体长小于4cm的鱼苗取整条鱼，体长为4cm～6cm的鱼苗取2 SC/T7211-2011内脏（包括头肾和脾脏)，体长大于6cm的鱼则取头肾、脾脏和心脏等组织，成熟雌鱼还