NY_T 3308-2018动物皮张源性成分鉴定 实时荧光定性PCR法.pdf

ICS 59.140.20B 45NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 3308—2018动物皮张源性成分鉴定实时荧光定性PCR法Identification of animal-derived materials in leather-Qualitative realtime PCR method2019-06-01实施2018-12-19 发布中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 3308—2018前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草：本标准由农业农村部畜牧兽医局提出，本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274)归口。本标准起草单位：山东省农业科学院生物技术研究中心-本标准主要起草人：步迅、范阳阳、刘艳艳、张全芳、胡悦、谷玉霞、马德源、李燕、杨雪、谭晴晴、陈雪燕、刘国霞、王兴军。1 NY/T 3308—2018动物皮张源性成分鉴定实时荧光定性PCR法1范围本标准规定了利用实时荧光定性PCR法对水貂、狐狸、兔、牛（普通牛、黄牛）、马、猪、羊（绵羊、山羊）、貉子和家犬9种动物皮张源性成分进行检测。本标准适用于动物皮张及初加工品中水貂、狐狸、兔、牛（普通牛、黄牛）、马、猪、羊（绵羊、山羊）、貉子和家犬9种源性成分的定性检测。本方法检出限为1%。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1实时荧光PCRqualitative realtime PCR在PCR反应体系中加人荧光基因，利用荧光信号积累实时监控整个PCR进程，对未知模板进行定性或定量分析。3. 2Ct 值cycle threshold每个实时荧光PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4原理根据线粒体16SrDNA基因在不同物种间保守区设计通用引物，在可变区设计物种特异性探针，采用TaqMan实时荧光PCR技术进行扩增，根据PCR扩增反应的荧光信号及循环阈值，判定水貂、狐狸、兔、牛（普通牛、黄牛）、马、猪、羊（绵羊、山羊）、貉子和家犬9种动物源性成分。5试剂或材料除另有规定外，仅使用分析纯试剂，5.1 水,GB/T 6682,级。5.21mol/L Tris-HCl(pH8.0)溶液：称取12.1g Tris置于100mL烧杯中,加人80 mL水，用浓 HCl调节pH至8.0，加水定容至100mL，103.4kPa(121℃)灭菌20min，室温保存待用。5.31mol/L Tris-HCl(pH6.4)溶液：称取12.1g Tris置于100mL烧杯中，加人80mL水，用浓HCl调节pH至6.4，加水定容至100mL，103.4kPa蒸汽压（121℃)灭菌20min，室温保存待用。5.40.5mol/LEDTA(pH8.0)溶液：称取18.61gNa2EDTA·2HzO置于100mL烧杯中，加人80mL水，用10%的NaOH溶液，调节pH至8.0，加水定容至100mL，高压灭菌后室温保存待用。 NY/T 3308—20185.510%十二烷基硫酸钠(SDS)：称取10gSDS溶解于80mL无菌水中，加水定容至100mL。储存于灭菌过的容器中待用。5.65mol/LNaCl溶液：称取29.22gNaCl溶解于80mL无菌水中，加水定容至100mL，在103.4kPa蒸汽压（121℃）条件下灭菌20min，室温保存待用。5.7 细胞裂解液(Lysis Buffer):取 1 mol/ L Tris -HCl(pH 8. 0)溶液 20 mL,0. 5 mol/L EDTA(pH8.0)溶液5mL，5.0mol/LNaCl溶液10mL，10%SDS溶液5mL，加水定容至100mL，混匀。5.820mg/mL蛋白酶K溶液：称量0.2g蛋白酶冻干品，加水溶解，加水定容至10mL，分装后于一20℃保存。5.9RNA酶溶液：将1g冻干品RNA酶A溶解于6mL无菌水中，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，加水定容至10mL，分装成小份存于一20℃。5.10硅珠悬浮液：取5g的硅胶加人到20mL的水中充分混合，静止24h，弃掉上清液，再加人20mL的水中充分混合，再静止5h,弃去上清液。在沉淀的硅珠中加入5mL的水，再加入5uL的浓盐酸，充分混合，调节pH至2.0。5.11 DNA结合液(Binding Buffer):称取 60 g异硫氰酸胍(GUSCN),加人5mL 1mol/L Tris-HCl(pH6.4)溶液，再加人8mL0.5mol/LEDTA（pH8