SN 1247.2-2003猪繁殖和呼吸综合征免疫过氧化物酶单层试验.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1247.2--2003猪繁殖和呼吸综合征免疫过氧化物酶单层试验Protocol of immunoperoxidase monolayer assay forporcine reproductive and respiratory syndrome2003-12-01实施2003-05-28 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1247.2-2003前 言本标准根据世界动物卫生组织(OIE)《哺乳动物、禽和蜜蜂 A 和 B类疾病诊断试验和疫苗标准手册》（第四版，2000)第三部分X.12的内容编写。本标准的附录 A、附录 B和附录 C 为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：苏永生、孙颖杰、简中友、孙延峰、潘凤城。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 SN/T 1247.2—2003猪繁殖和呼吸综合征免疫过氧化物酶单层试验1 范围本标推规定了应用免疫过氧化物酶单层试验检测猪繁殖和呼吸综合征抗体的操作方法。本标准适用于猪繁殖和呼吸综合征的流行病学调查、诊断、检疫和疫情监测。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682—1992分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本标推。3.1 AEC氨乙基味唑。3.2 HPRO辣根过氧化物酶。3.3 IPMA免疫过氧化物酶单层试验。3.4 PRRS猪繁殖和呼吸综合征。4 检验检疫4.1原理免疫过氧化物酶单层试验是将抗原吸附于固相载体上，加人被检样品形成抗原抗体复合物，在加人酶标记的抗抗休，在底物的参与下而显色，底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果。本标准的反应原理就是在96 孔细胞培养板上培养接种猪繁殖和呼吸综合征病葬的细胞，固定后加人按一定比例稀释的待检血清，反应结束后，加入用HPRO标记的抗猪免疫球蛋白抗体，反应完成后，加人底物并检测反应结果。4.2采样采集被检猪血液，分离血清，血清必须新鲜透明不溶血无污染，密装于灭菌小瓶内，4℃或一20℃～一30℃冰箱保存或冷藏条件下立即送检。试验前将被检血清统一编号。4.3设备和材料4.3.1仪器设备微量移液器；保湿盒;普通恒温箱及二氧化碳恒温箱；-普通冰箱和低温冰箱；倒置显微镜； SN/T 1247.2—2003一量简、烧杯等。4.3.2材料和试剂MARC-145或HS,H细胞由国家质检总局指定单位提供；-PRRS美洲标准株ATCCVR-2332或欧洲标准株LV标准毒由国家质检总局指定单位提供；-PRRS 病毒标准阳性血清和标准阴性血清由国家质检总局指定单位提供；-HPRO标记的免抗猪抗抗体，由国家质检总局指定单位提供，使用前按说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度；洗涤液、血清稀释液、乙酸钠缓冲液、细胞分散液、PBS液和AEC溶液（见附录A)；一IPMA诊断板的制备（见附录B、附录 C)。4.4免疫过氧化物酶单层试验操作方法4.4.1在空白的96孔板的A和E排各孔加180μL血清稀释液,其余各孔加120μL,血清稀释液。在A和E排孔内加人被检血清或对照血消20 μL(为 1/10稀释),摇动。从A到D排，从E到H排把血清依次做四倍稀释，则四个孔的血清稀释分别为1/10、1/40、1/160和1/640。4.4.2从血清稀释板每孔取50μl.加人已固定的IPMA诊断板相应孔内，封板并于37℃条件下孵育1 h。4.4.3弃去板中液体，用洗涤液洗板三次，每孔100 μL,每次 1min～3min，最后倒置在吸水纸上轻轻拍干。4.4.4每孔加人用洗涤液稀释的工作浓度的用HPRO标记的兔抗猪抗抗体50μL，封板后放在保湿盒内于37℃恒温箱中感作1 h。4.4.5弃去板中液体，洗涤三次，方法商4.4.3。4.4.6每孔加人AEC溶液50μL，封板闭光于室温（18℃～24℃)下感作30min。4.4.7弃去板中AEC溶液，洗涤一次，方法同4.4.3。再加入乙酸钠缓冲液50μL待检。4.5结果判定与解释4.5.1判定方法将IPMA诊断板置于倒置显微镜下判读。4.5.2判定标准试验血清内如果存在抗体(包括标阳性对照血清、阳性血清)，则孔内约有30%～50%细胞的胞质被底物染成深红色。阴性试验血清则可见胞质未被染色。血清非特异性反应使整孔染色，可与阳性对照血清相比较。血清滴度以50%或50%以上的孔染色的最高稀释度的倒数表示。血清滴度小于10为阴性，10