SN_T 3306.14-2017国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法 第14部分：大肠杆菌O157:H7.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3306.14—2017国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法第 14 部分：大肠杆菌0157：H7Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port-Part 14 :Escherichia coli O157:H72017-12-01实施2017-05-12 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局刮涂层查真伪 SN/T 3306.14--2017前 言SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩增（LAMP)检测方法》分为14个部分：第1部分：鼠疫杆菌；第2部分：产毒素霍乱弧菌；第3部分：志贺氏菌；第4部分：嗜肺军团菌；第5部分：布鲁氏菌；第6部分：黄热病毒；第 7 部分:猴痘病毒;第8部分:基孔肯雅病毒;第9部分：结核分枝杆菌；第10部分：炭疽芽孢杆菌；第11部分：副溶血性弧菌；第12部分：空肠弯曲菌；第13部分：疮原虫；一第14部分：大肠杆菌0157：H7。本部分为SN/T3306的第14部分。本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本部分主要起草人：祁军、詹曦菁、滑娜、赵欣、左锋。m SN/T 3306.14-2017国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法第14部分：大肠杆菌0157：H71范围SN/T3306的本部分规定了在国境口岸利用环介导恒温核酸扩增（1.AMP)法检测大肠杆菌0157：H7的检测对象、检测程序及检测结果的报告。本部分适用于国境口岸大肠杆菌0157：H7菌株的筛选检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB4789.36食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求WS/T 230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用WS271感染性腹泻诊断标准人间传染的病原微生物名录（卫科教发（2006）15号）3缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA:脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid)dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid)LAMP:环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification)Triton X-ioo：聚乙二醇辛基苯基醚4　生物安全及防污染措施实验生物安全要求、操作及处理按照GB19489和《人间传染的病原微生物名录》的规定执行，由通过生物安全培训并具备资质的工作人员进行。防止污染措施应符合WS/T230的规定。5技术概要根据大肠杆菌O157:H7rfbE基因序列设计特异性内外引物及环状引物各一对,共三对引物，特异性识别靶序列上的rfbE基因，利用Bst酶启动循环链置换反应，在特异性基因序列启动互补链合成，在1 SN/T 3306.14--2017同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²+结合，产生副产物（焦磷酸镁)形成乳白色沉淀，即可通过反应液中的浑浊程度判定结果。亦可通过加入显色液，通过颜色变化观察判定结果。6试剂和材料除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中-级水的要求。6.1 引物。根据大肠杆菌O157：H7特有的rf6E序列靶序列基因（JQ907522.1)设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1，内引物2和环状引物1，环状引物2。外引物1(F3,5′-3′):AACAGTCTTGTACAAGTCCA外引物 2(B3,5-3′):GGTGCTTTTGATATTTTTCCG内弓1物 1(FIP,5′-3）:CTCTCTTTCCTCTGCGGTCCGATGTTTTTCACACTTATTGGAT内引物 2(BIP,5′-3’):TAAGGAATCACCTTGCAGATAAACTAGTACATTGGCATCGTGT环状引物 1(LF,5′-3′):CCAGAGTTAAGATTGAT环状引物 2(LB,5′-3）:CGAAACAAGGCCAGTTTTTTACC6.2 DNA 提取液:含 20 mmol/L