SNT 2097-2008入出境人员猴痘检验规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2097—2008入出境人员猴痘检验规程Codes for examination of monkeypox at entry-exit port2008-07-17发布2009-02-01实施中华人民共和国发布-()国家质量监督检验检疫总局食程较要1072查波表,数码防伪 SN/T 2097—2008言前本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国惠州出人境检验检疫局、中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所。本标准主要起草人：幸芦琴、李小波、钟玉清、阮力、师永霞、郭波旋、黄吉城、洪烨、相大鹏、郑。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 SN/T 2097—2008入出境人员猴痘检验规程1范围本标准规定了人出境口岸人出境人员猴痘病毒的实验室检验方法与结果报告，包括样本采集、处理，检验程序、方法，结果判定及报告。本标准适用于人出境口岸猴痘病毒的实验室检验。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2. 1猴痘monkeypox由猴痘病毒（monkeypox virus)引起的人兽共患传染病，临床主要表现有高热、头痛、背痛、全身不适、咳嗽、淋巴结肿大，伴全身出现类似天花的皮疹，偶尔出现腹痛。2.2实时荧光 PCR real-time fluorescence PCR实时荧光PCR方法是在常规 PCR的基础上，加入一条特异性的荧光探针。该探针为段寡核苷酸，两端分别标记一个报告基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，利用 Taq酶的5°-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链；就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步。2.3Ct 值 cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定的值时所经历的循环数。3仪器和设备需要如下仪器设备。-Roche荧光定量 PCR 仪;一生物安全柜;高压灭菌器;普通冰箱;普通台式离心机（带密封的离心安全杯）；冷冻离心机（带密封的离心安全杯）；研钵；涡旋器。4 试剂4.1核酸提取试剂:使用 TakaRa 基因组 DNA 提取试剂盒1),详见说明书。4.2Hot-Start Mix master 反应试剂盒购自 Roche 公司1）。1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 SN/T 2097---20084.3灭菌双蒸水。4.4实时荧光 PCR检测的引物和探针F3L-F 5-CTCATTGATTTTTCGCGGGATA-3F3L-R5-GACGATACTCCTCCTCGTTGGT-3F3L-P-MGB 5FAM-CATCAGAATCTGTAGGCCGT-MGBNFQ-35样本采集5.1皮疹、痴皮采集：取皮疹上盖或痴皮，装人2 mL的灭菌塑料管里，密封，4℃或 4℃以下保存运输。5.2水疱液、脓疱液采集：用附有注射针的一次性注射器吸取 0.2 mL 的 PBS,从疱膜插人,来回2 次～3次混匀后吸取内容液，把吸取的内容液装人血清管，4℃或4℃以下保存运输。5.3全血采集：静脉采集疑似病人抗凝全血_5mL4℃或4℃以下保存运输。6样本处理使用 TakaRa 基因组 DNA 提取试剂盒制备病毒核酸。6.1提取试剂准备(在使用前进行）溶液A、溶液 B若出现沉淀，于 65℃加热溶解，待恢复至室温后使用。6.2 病毒核酸提取步骤6.2.1样本制备皮疹、痴皮等病变组织|取,1.mg～100 mg,的病变组织移人冰浴预冷的研钵中,快速用力研成匀浆（富含胶原蛋白的皮肤等组织需加液氮研磨至粉末状)；加人650μL的溶液 A和0.9μL的RNaseA1,温和研磨30 s;收集650μL研磨好的组织勾浆移至收集管中,如果匀浆不足650μL,补充溶液 A至650 μL,65℃水浴 5 min。水疱液、脓疱液及病人血液取250 μL的水疱液、脓疱液及病人全血(含抗凝剂)加人收集管1,激烈振荡15.s后，冰浴5min。中;加人 500 μL的溶液 A;加人 1L的RNase?.6.2.2加人400 μL的溶液B,振荡混合。6.2.3加人1mL的4℃预冷的溶液C充分混勾后，12000xmin离心2min。6.2.4　弃去上层有机相，再加尽1-mL/的4℃预冷的漆液C,充分混匀后，12000r/min离心2min。6.2.5弃去上层有机相，然后将水相溶液（无色下层）转移至置于收集管上的滤杯中，12000r/min离心 1 min。6.2.6 弃滤杯,在溶液中加入 4b0