SNT 2206.7-2010化妆品微生物检测方法 第7部分：蛋白免疫印迹法检测疯牛病病原.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2206.7--2010化妆品微生物检测方法第7部分：蛋白免疫印迹法检测疯牛病病原Determination of microbiological in cosmetics-Part 7 :Determination of bovine spongiform encephalopathy (BSE) bywestern blot method2010-03-02 发布2010-09-16 实施中华人民共和国5105615毫查真发布数码防伪国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2206.7--2010言前 SN/T2206《化妆品微生物检测方法》系列标准共分为7部分：第1部分：沙门氏菌;第2部分：需氧芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌；-第3部分：肺炎克雷伯氏菌；111-第4部分：链球菌；-第5部分：肠球菌；-第6部分：破伤风梭菌；第7部分:蛋白免疫印迹法检测疯牛病病原。本部分为SN/T2206的第7部分。本部分附录A为规范性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局。本部分主要起草人：马贵平、史喜菊、李炎鑫、刘全国、李冰玲、刘旭辉。本部分系首次发布的检验检疫行业标准。 SN/T 2206.72010化妆品微生物检测方法第7部分：蛋白免疫印迹法检测疯牛病病原 范围1SN/T 2206的本部分规定了进出口化妆品中疯牛病病原检测-蛋白免疫印迹法。本部分适用于化妆品中疯牛病病原的检测2规范性引用文件下列文件中的条款通过SN/T2206的本部分的号用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T 6682　分析实验用水规格和试验方法GB19489实验室生物安奎通用要求化妆品卫生规范(卫生部)3缩略语下列缩略语适用于 SN/T2206,的本部分3. 1western blot蛋白免疫印迹。3. 2PrP蛋白。3.3Prpc细胞型脆蛋白。3. 4Prpsc致病性蛋白。3. 5PK蛋白酶 K。3.6PMSF苯甲基磺酰氟。3.7tris base三(羟甲基)氨基甲烷。 SN/T 2206.7—20103.8SDS十二烷基硫酸钠。3.9SDS十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。3. 10PVDF聚偏二氟乙烯。3. 11PBS磷酸盐缓冲盐水。3. 12ECL电化学发光。4主要仪器设备4.1生物安全柜(2BⅡ型）。4.2台式高速离心机（最高离心力可达12000g以上）。4.3组织匀浆机。4.4垂直电泳系统(含转印装置）。4.5水浴锅（温度可达到100℃士1℃）。4.6恒温培养箱(37℃±0.5℃）。4.7X光片洗片机。4.8磁力搅拌器和搅拌子（可以加热）。微量可调移液器(2 μL、10 μL、100 μL、1 000 μL)和相应吸头。4.9↑4.10各种冰箱(精度分别达到4℃±3℃、-20℃±5℃和－70℃±10℃)。高压灭菌锅（温度可达到135℃）。4.114.12PVDF转印膜(0.45 μm)。5方法原理疯牛病的病原是宿主细胞编码的一种正常蛋白质的异构体,这种正常蛋白简称为 PrP°,其异构体简称为 PrPsc。正常的 PrP°对蛋白酶 K 敏感,不致病;但其异构体 PrP℃对蛋白酶 K有抗性,可致病,称为病毒(prion）。将被检化妆品制备成可溶性溶液,分成两等份，一份用蛋白酶K消化，另一份不用蛋白酶K消化，然后进行蛋白质电泳和转印试验，在 PVDF 膜上进行抗原抗体反应。如果出现特异性条带，即可判定被检化妆品溶液中存在 PrP℃。6 试剂6.112%Tris-Glycine 预制凝胶(或自制 12%Tris-甘氨酸-SDS 聚丙烯酰胺凝胶）。6.2PrP单克隆抗体（鼠抗PrPIgG1,如6H4）。6.3辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG。2 SN/T 2206.7—20106.4裂解缓冲液(配方见附录第 A.1章）。6.5SDS上样缓冲液（配方见附录第 A.2章）。6.6电泳缓冲液（配方见附录第A.3章）。6.7电转缓冲液（配方见附录第A.4章）。6.8PBS(pH 7.4)（配方见附录第 A.5 章）。6.9PBS-Tween20(配方见附录第 A.6 章）。6.10PK储存液（配方见附录第 A.7章）。6.11ECL（电化学发光增强剂，配方见附录第A.8章）。6.122PMSF(蛋白酶抑制剂,配方见附录第 A.9章）。6.133DMSO(分析级纯）。6.14乙醇(分析级纯）。6.15实验用水：所有试剂的配制用水应为蒸馏水或去离子水，符合GB/T6682的要求。7