SN_T 3872-2014出口食品中四种致病菌检测方法 MALDI-TOF-MS法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3872—2014出口食品中四种致病菌检测方法MALDI-TOF-MS 法Detection of four pathogens in food for export-MALDI-TOF-MS method2014-08-01实施2014-01-13 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局涂层套真伪 SN/T 3872—2014前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：曹际娟、郑秋月、董伟峰、曹冬梅、黄大亮、赵昕、麻丽丹。1 SN/T 3872--2014出口食品中四种致病菌检测方法MALDI-TOF-MS 法1范围本标准规定了食品中四种致病菌的 MAILDI-TOF-MS检测方法。本标准适用于食品中沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌四种致病菌的快速检测，其他致病菌可参照使用。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB4789.4食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验GB4789.7食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验GB4789.30食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求SN0170出口食品沙门氏菌属（包括亚利桑那菌）检验方法SN/T0173　进出口食品中副溶血性弧菌检验方法SN/T 0184.1进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法SN/T1022进出口食品中霍乱弧菌检验方法NMKI.No.156食品中致病性弧菌的检测和计数3缩略语下列缩略语适用于本文件。3.1 MALDI-TOF-MS: Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry，基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱。3.2 CHCA:α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid,α-氰-4-羟基肉桂酸。3.3 ACN:acetonitrile,乙腈。3.4 TFA:trifluoroacetic acid,三氟乙酸。4　方法提要MALDI-TOF-MS 是应用于细菌全细胞快速检测的技术，主要依据存在于细菌表面特征性蛋白的分子量信息，完成细菌的鉴定和分类。将待鉴定的菌落样品与适量的基质溶液点加在样品板上，溶剂挥发后形成样品与基质的共结晶，利用激光作为能量来源辐射共结晶体，基质分子吸收能量与样品解吸附I SN/T 3872-2014并使样品电离,经过飞行时间检测器,将不同质荷比的离子分开,形成细菌特异性的质谱图。将待测细菌质谱图与已知细菌的标准蛋白质组指纹质谱数据库进行比较，可以确定细菌的种属，进行细菌鉴定，从而对食品中的致病菌进行快速检测。5试剂和材料除另有规定外，所有试剂均使用色谱纯试剂。实验用水应符合GB/T 6682中一级水的规格。5.1乙腈。5.2无水乙醇。5.3甲酸。5.4 三氟乙酸。5.5α-氰-4-羟基肉桂酸。5.6肽标准品:校准范围 1 000 Da～4 000 Da5.7蛋白标准品：校准范围 3 000 Da～25 000 Da。5.8基质溶液：将基质CHCA粉末加人到含有50%乙腈、2.5%三氟乙酸的水溶液中，配制成饱和溶液。基质溶液现用现配，每次使用时新鲜配制。5.9标准品溶液：将1mg肽标准品干粉、1.mg蛋白标准品干粉分别溶于ACN：TFA：水的比例为30：0.1：69.9的溶液中,将肽溶液与蛋白溶液以1：5的比例混合后配制成标准品溶液。6主要仪器和设备6.1基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪。6.2离心机：最大离心力≥16000g。6.3微量可调移液器和灭菌吸头:2μL,10μL,100 μL,200μL,1.000μL。7检测步骤7.1检测流程图食品中致病菌MALDI-TOF-MS检测流程见图1。2 SN/T鉴定的分离菌落菌落处理点样MALDI - TOF -MS检测阴性结果可疑阳性结果传统方法确认结果报告图‘1：MALDI-TOF-MS 法检测致病菌的流程图7.2　样品制备、增菌培养和分离食品中沙门氏菌检测样品的制备、增菌培养和分离步骤参照GB4789.4或SN0170方法进行。7.2.1食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测样品的制备、增菌培养和分离步骤参照GB4789.30或7.2.2SN/T 0184.1方法进行。3食品中副溶血性弧菌检测样品的