SN_T 3487-2013猴痘检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3487--2013猴痘检疫技术规范Quarantine protocol for monkeypox2013-09-16 实施2013-03-01发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3487—2013前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国宁波出人境检验检疫局。本标准主要起草人：张敬友、唐泰山、王凯民、陈国强、张睿、陈雷、姜焱、蒋原、张常印、黄素文。 SN/T 3487—2013猴痘检疫技术规范范围1本标准规定了猴痘病毒 PCR 和荧光 PCR检疫规范。本标准适用于猴痘的流行病学调查和口岸检疫。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所看的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验法3缩略语下列缩略语适用于本文件。Ct值：荧光信号到达设定的阈值所经历的循环数dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸DNA:脱氧核糖核酸HEX:六氯-6-甲基荧光素PCR:聚合酶链式反应荧光PCR:荧光聚合酶链式反应临床症状4皮疹，包括斑点状皮疹、突起状皮疹、小永泡状皮疹、脓包状皮疹、全身性或局部性皮疹、分散性或融合性皮疹;结膜炎；鼻炎；咳嗽;食欲不振;嗜睡。参见附录 Al5 实验室诊断5.1 PCR 试验5.1.1试验仪器5. 1. 1. 1PCR热循环仪。电泳仪。5. 1. 1. 3凝胶成像系统。5. 1.2 试剂试剂级别：除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T6682规定的二级水，所用化学试剂均为分析纯。裂解液配制见附录B的B.1,TE缓冲液配制方法见B.2,电泳缓冲液TAE配制方法见B.3，2%琼脂糖凝胶板制备见B.4。1 SN/T 3487--20人工合成的猴痘病毒阳性核酸片段作为阳性对照，以不含猴痘病毒的动物组织核酸提取物为阴性对照，以灭菌水为空白对照。 引物:引物 1(20 pmol/μL):5-TTCCGTCAATGTCTACACAGGCA-3引物 2(20 pmol/μL):5-TACAGTTCCGACGATACTCCTCC-3*PCR 反应试剂:10 倍 PCR 反应缓冲液、2.5 mmol/L dNTPs、MgCl2、5 U/μl,Taq DNA 聚合酶等使用商品化试剂。电泳加样缓冲液：30%的甘油水溶液中加桔黄G到0.25%（质量浓度）。 DNA 分子量标记:100 bp～2 000 bp。5.1.3操作方法样品采集5. 1.3. 1. 1皮疹、痴皮采集取皮疹上盖或痴皮,装人灭菌塑料管中，密封，4℃或4℃以下保存运输，7d内完成检测。.2水疱液、脓疱液采集用无菌注射器采集水疱液、脓疱液250μL，4℃或4℃以下保存运输，7d内完成检测。.3全血采集无菌采集疑似动物肝素抗凝全血2mL,4℃或 4℃以下保存运输，7d内完成检测。样品DNA的制备.1取0.2 g～1.0g皮疹、痴皮组织，加入等量灭菌石英砂充分研磨。然后按照1：5比例（质量体积)加人 0.01mol/L PBS(pH7.6～7.8)，一20℃反复冻融2次。然后4℃、8000 r/min离心5 min。水疱液、脓疱液和全血等液体样品不需经过此步骤，直接进人下一步。.2取上清液或液体样品200μl，加人1.5mI.离心管内，加人400ml细胞裂解液，反复颠倒混匀;加人600 μL的酚/三氯甲烷混合液混匀，4℃、12000r/min离心5min;取上清液加人600μl.三氯甲烷混匀，12000r/min离心5min；取上清液加入0.8倍的异丙醇混匀勾并10000r/min离心10min；弃去上清液，加人70%乙醇洗涤，离心5min，晾干后加人50μl.TE缓冲液溶解沉淀，备用。PCR 反应体系配制采用20 μL的反应体系：2μI.10倍 PCR反应缓冲液、0.4 μl.的25 mmol/I.MgCl²、0.2 μl.的5 U/μL Taq DNA 聚合酶、引物 1、引物 2 各 0. 4 μL、0. 4 μl 2.5 mmol/L dNTPs,用水补至 20. 0 μl。取比待检样品数多两只的含有PCR反应混合物的PCR管，分别加人待检样品DNA提取物、阴性对照、阳性对照及空白对照0.5μL到相应 PCR管中，2000 r/min离心10 s，立即进行PCR扩增。PCR 反应的循环程序将 PCR管放人PCR热循环仪中，按下列程序进行DNA扩增：95℃预变性5 min后，95℃ 1min.51 ℃ 1 min,72℃ 1 min,共35个循环;最后 72℃延伸 10