SN_T 4877.4-2017基因条形码筛查方法 第4部分：检疫性茎点霉.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4877.4—2017基因条形码筛查方法第4部分：检疫性茎点霉DNA barcoding screening method-Part 4 :Quarantine Phoma spp.2017-08-29发布2018-04-01实施中华人民共和国发布O国家质量监督检验检疫总局 SN/T4877.4—2017前言SN/T4877《基因条形码筛查方法》分为10个部分：第1部分：检疫性棒形杆菌；第2部分：检疫性黄单胞菌；第3部分：检疫性植原体；第4部分：检疫性茎点霉；第5部分：检疫性拟茎点霉；第6部分：检疫性嗜酸菌；第7部分：检疫性轮枝菌；第8部分：检疫性炭疽菌；第9部分：检疫性腥黑粉菌；第10部分：检疫性疫霉。本部分为SN/T4877的第4部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中国科学院微生物研究所、中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院本部分起草人：段维军、蔡磊、陈倩、廖芳、郭立新、张慧丽、陈先锋、朱水芳。I SN/T4877.4—2017基因条形码筛查方法第4部分：检疫性茎点霉1范围SN/T4877的本部分规定了检疫性茎点霉DNA条形码筛查方法本部分适用于进境植物及其产品中检疫性茎点霉的筛查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1135.8马铃薯环疽病菌检疫鉴定方法SN/T2589植物病原真菌检测规范SN/T 3288柠檬干枯病菌检疫鉴定方法SN/T3682葡萄茎枯病菌检疫鉴定方SN/T3755豌豆脚腐病菌检疫鉴定方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1DNA条形码DNAbarcode生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。3.2内部间隔转录区序列internaltranscribedspacer；ITS在真核生物中，核糖体DNA是由核糖体基因及与之相邻的间隔区组成，其基因组序列从5～3依次为：外部转录间隔区、18S基因、内部转录间隔区1ITS1）、5.8S基因、内部转录间隔区2(ITS2）、28S基因和基因间隔序列。内转录间隔区是存在于18SrDNA、5.8SrDNA和28SrDNA之间的区域，ITS1和ITS2作为非编码区，受外界环境因素的影响较小，与编码区域相比具有进化速度快的特点，在种内的不同菌株之间高度保守，而在真菌种间存在极大的变化，表现出极大的序列多态性，能够提供详尽的系统学分析所需的可遗传性状。3.3β-微管蛋白基因beta-tubulin，TUBβ-微管蛋白基因既有保守的外显子又有许多内含子，已被用于真菌各级分类水平上的系统发育研究。并且发现其无论在低分类阶元的系统发育研究中，还是复合种的研究中，甚至对于种内不同地域菌株间的亲缘关系研究有重要意义。β-微管蛋白基因已在茎点霉属部分物种的研究中显示出较好的区分程度。1 SN/T4877.4—20173.4检疫性茎点霉QuarantinePhomaspp农业部和国家质检总局于2007年5月29日发布的第862号公告《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中将植物病原真菌茎点霉属（Phoma）中的马铃薯环疽病菌PhomaeriguaDesmazieresf.sp.foveata（Foister）Boerema、葡萄茎枯病菌Phomaglomerata（Corda)WollenweberetHochapfel、豌豆脚腐病菌Phomapinodella（L.K.Jones）Morgan-JonesetK.B.Burch和柠檬干枯病菌Phomatracheiphila（Petri）L.A.Kantsch，etGikaschvili列为我国禁止进境检疫性有害生物。马铃薯环疽病菌、葡萄茎枯病菌、豌豆脚腐病菌和柠檬干枯病菌详细分类信息见SN/T1135.8、SN/T3682、SN/T3755、SN/T3288。4方法原理根据茎点霉属真菌的核糖体转录间隔区（ITS)和β微管蛋白片段（TUB)的序列特征，应用DNA条形码技术对检疫性茎点霉进行种类筛查，确定目标真菌是否为检疫性茎点霉及其种属归类。51仪器用具和试剂5.1仪器设备与用具显微镜、高压灭菌锅、超净工作台、组织破碎仪、恒温水浴锅、台式冷冻离心机、微量分光光度仪、电子天平、超纯水仪、漩涡振荡器、冰箱、微量移液器（0.5μL，2.5μL，10μL，20μL，200μL，1000μ