NY_T 2069-2011牛乳中孕酮含量的测定高效液相色谱-质谱法.pdf

ICS 67.100.01X 16NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2069-2011牛乳中孕酮含量的测定高效液相色谱一质谱法Determination of progesterone in milk by HPLC-MS2011-09-01发布2011-12-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T2069—2011前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274)归口。本标准负责起草单位：中国科学院沈阳应用生态研究所农产品安全与环境质量检测中心。本标准起草人：王颜红、张红、齐伟、王世成、林桂凤、李波、王姗姗。I NY/T 2069—2011牛乳中孕酮含量的测定，高效液相色谱一质谱法1范围本标准规定了牛乳中孕酮含量的高效液相色谱一质谱测定方法。本标准适用于牛乳中孕酮含量的测定。本标准的方法检出限为1ug/kg。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理试料经甲醇溶液提取后，经C18萃取柱净化，经电喷雾离子源高效液相色谱一质谱测定，保留时间和选择离子丰度比定性，外标法定量。4试剂和材料除特殊注明外，本方法仅使用确认为分析纯的试剂。水应为GB/T6682一级用水。4.1乙睛：色谱纯。4.2甲醇。4.3乙酸铵溶液[c(CH.COONH4）=3mmol/L]：称取0.231g乙酸铵于1000mL容量瓶中，定容，过0.45um水相滤膜。4.4乙酸铅溶液：称取20g乙酸铅三水合物EPb(CH:COO)2·3HzO]，溶解于100mL的水中，配成质量分数为20%的乙酸铅溶液。4.5标准溶液4.5.1孕酮标准贮备液：质量浓度为100μg/mL。准确称取0.010g（精确到0.0001g)孕酮（纯度≥98%），用甲醇（4.2)溶解并定容至100mL。于0℃～4℃贮存，贮存期三个月。4.5.2孕酮标准使用液根据工作需要，用甲醇对标准贮备液（4.5.1)进行稀释。于0℃～4℃贮存。贮存期一个月。5仪器设备5.1高效液相色谱一质谱联用仪：配有电喷雾离子源和四级杆质量分析器。5.2高速离心机：10000r/min。5.3超声波发生器。5.4涡旋震荡仪。5.5分析天平：感量为0.0001g。5.6天平：感量为0.001g。5.7Clg固相萃取柱：500mg，6mL。 NY/T 2069—20115.8滤膜：孔径0.45μm6测定步骤6.1样品提取准确称取5g试料（精确至0.001g），置于50mL离心管中，加人15mL甲醇（4.2）和1mL乙酸铅溶液（4.4），涡旋30s，超声提取10min，10000r/min离心10min。取上清液于25rnL容量瓶，残渣再加人5mL甲醇（4.2），涡旋30s，超声提取10min，10000r/min离心10min。合并上清液，用甲醇（4.2）定容，得到甲醇提取液。6.2样品净化取Ci8萃取柱进行活化处理，加入5mL甲醇（4.2），近流干时，加入5mL水淋洗，抽至水面刚达到填料表面。取5.00mL甲醇（4.2）提取液，加入5mL水混合后，倾入C萃取柱（流速为1mL/min），用5ml水淋洗，抽干后，用乙睛（4.1)洗脱，定容至2.00mL。洗脱液过0.45um滤膜，供高效液相色谱质谱联用仪测定。6.3基质标准曲线的制备应用本标准方法进行牛乳中孕酮含量的检测，获得总离子流图和质谱谱图。试样总离子流图在孕酮标准总离子流图对应的保留时间土5%范围内中无色谱峰，且该范围内无孕酮特征离子，则该牛乳为基质试样。称取5g（精确至0.001g）基质试样6份，分别准确移取标准使用液（4.5.2)0.00mL、0.01mL、0.05mL、0.10mL、0.50mL、1.00mL，加入到空白试样中，按6.1、6.2步骤操作，供高效液相色谱一质谱联用仪测定，制作标准曲线。6.4测定6.4.1高效液相色谱参考条件色谱柱：C8，3.5μm，2.1mmX150mm，或相当者。流动相：乙（4.1）十乙酸铵溶液（4.3）（65十35）。流速:0.3 mL/min。柱温：40℃。进样量：10μL。6.4.2质谱参考条件离子源：电喷雾离子源。扫描方式：正离子扫描。毛细管电压：4.00kV。锥孔电压：30.0V。源温度：120℃。脱溶剂气温度：350℃。锥孔反吹气流速：100L/h。脱溶剂气流速：450L/h。特征选择离子（m/z）：97，109，315。6.4.3高效液相色谱一质谱测定取孕酮标准工作溶液系列（6.3)及试液各10uL，分别注人高效液相色谱一质谱联用仪进