SN_T 4880-2017亨德拉病检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4880—2017亨德拉病检疫技术规范Quarantine protocol for Hendra disease2018-04-01实施2017-08-29 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局、刮涂层查真伪 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准亨德拉病检疫技术规范SN/T 4880---2017*中国标出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045)总编室：（010址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本 880×1230 1/16印张 0.75字数 18千字2018年5月第，反　2018年5月第一次印刷版印数 1—500*书号：155066·2-32827 SN/T 4880—2017前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准修改采用了世界动物卫生组织（OIE）《陆生动物诊断试验与疫苗手册》（2015版）第2.9.6章中亨德拉和尼帕病毒诊断有关章节，本标准与世界动物卫生组织（OIE）《陆生动物诊断试验与疫苗手册》（2015版）第2.9.6章中亨德拉和尼帕病毒诊断等有关章节的主要区别在于对其中酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)和实时 RT-PCR检测方法进行了细化。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国烟台出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国荣成出人境检验检疫局。本标准主要起草人：尹伟力、孙涛、刘瑶、鲁闽、梁成珠、岳志芹、王群、刘宁。 SN/T 4880--2017亨德拉病检疫技术规范1范围本标准规定了亨德拉病的实时荧光聚合酶链式反应（Real-time PCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作的技术规范。本标准适用于亨德拉病毒感染的检测和监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注目期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求3生物安全措施亨德拉病毒对人极具危险（参见附录A）。因此，用于亨德拉病毒检测的相关病料、组织样品，须经过灭活处理，其分子生物学和血清学检测须在二级生物安全实验室中进行。为了防止疫病传播，同时保护实验人员的安全，试验应由具有一定资格的专业技术人员操作，所有经前处理的检测病料及样品、培养物及废弃物等须经高压灭菌处理。试验环境和防护要求严格遵守GB19489。4缩略语下列缩略语适用于本文件。cDNA:互补 DNA(Complementary DNA)DEPC:焦碳酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate)dNTP:脱氧核苷三磷酸(Deoxy-ribonucleoside triphosphate)HeV:亨德拉病毒(Hendra virus)M-MLV:莫洛尼鼠类白血病病毒(Moloney murine leukemia virus)PBS:磷酸盐缓冲盐水(Phosphate buffered saline)RT-PCR:反转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction)5样品采集与运输活动物需要采集鼻腔或口腔鼻咽部拭子、尿液、血清。病死动物需无菌采集脑、肺、肾和脾脏等组织。样品需要放于二级生物样品安全转移箱进行运输。如在48h内能到达实验室，则只需保存在4℃保存运送到实验室进行检测；若运输时间超过48h，则样品需在干冰或液氮状态下冰冻运输，但病料不能长期存放在20℃。 SN/T 4880--20176荧光 PCR 检测6.1主要试剂、材料与设备6.1.1病毒 RNA提取试剂 Trizol、氯仿、异丙醇、无水乙醇。6.1.2M-MLV反转录酶(200U/μL)及相应5×反转录反应缓冲液、RNA酶抑制剂（40U/μL）、Taq酶及相应 10X缓冲液、25 mmol/L MgCl²、2.5 mmol/I.dNTP。6.1.3采用以下引物及探针检测：上游引物序列(F1):5′-GAT-ATI-TTT-GAM-GAG-GCG-GCT-AGT-T-3’下游引物序列(R2):5-CCC-ATC-TCA-GTT-CTG-GGC-TAT-TAG-3。TagMan 探针序列: 5-FAM-CTA-CTT-TGA-CTA-CTA-AGA-TAA-GA-TAMRA-36.1.4高速冷冻离心机、台式小型离心机、超净工作台、混匀器、荧光PCR仪。6.2实验步骤6.2.1样品处理用于亨德拉病毒检测的相关病料、组织样品，应经过射线辐照灭活（辐照剂量为6000