SN 1165.2-2002蓝舌病琼脂免疫扩散试验操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1165.2--2002蓝舌病琼脂免疫扩散试验操作规程Protocol of agar gel immuno-diffusion test for bluetongue2002-11-25发布2003-05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1165.2--2002前言本方法参考OIE的标准（《国际兽疫局诊断试验和疫苗标准手册》,1996年，第三版)的方法，并根据我国在这一领域多年研究经验制定的。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国云南出人境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人：贾建军、旦有民、徐自忠、赵颜润。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 SN/T 1165.2-2002蓝舌病琼脂免疫扩散试验操作规程1 范围本标准规定了蓝舌病琼脂免疫扩散试验操作规程。本标准适用于动物蓝舌病抗体的检测和诊断。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682—1992分析实验室用水规格和试验方法（eqvISO3696：1987)3缩略语下列缩略语适用于本标准。3.1 AGID Test:琼脂免疫扩散试验。3.2 BT:蓝舌病。3.3BTV:蓝舌病病毒。4原理抗原和抗体的分子质量一般都在2×10°U以下，抗原及其特异性抗体在凝胶中从高浓度区域向低浓度区域扩散时所受阻力很小，基本上呈自由扩散形式。由于不同抗原分子的分子质量、结构、形状和电荷量不同，因此其扩散系数不同，在凝胶中的扩散速度也就不同。当抗原与相应抗体经扩散后在凝胶中相遇，形成抗原抗体复合物，若两者在相遇处比例适当，则形成最大的复合物。由于复合物的分子质量增大，颗粒增大，因而不再继续扩散而产生沉淀，呈现出线状或带状，其形成的线状或带状的“特异性屏障”称为免疫沉淀线或免疫沉淀带，可根据抗原与阳性血清之间出现这种沉淀带，抗原与被检血清之间是否出现沉淀带来判定被检血清中是否存在抗体。5试剂和材料5.1抗原：用从美国国家兽医实验室引进的BTV17型国际标准毒株，参考该实验室的抗原制备方法制备，为群特异性抗原，适用于各型蓝舌病的检疫，由指定单位提供。5.2标准阳性血清：用从美国国家兽医实验室引进的蓝舌病国际标准毒株,按常规高免血清制备方法制备，琼脂扩散效价在1：8以上，由指定单位提供。5.3阴性血清：无 BTV抗体的血清，由指定单位提供。5.4平Ⅲ：普通平皿。5.5微量移液器：普通微量移液器。5.6微量滴头：与移液器配套滴头。5.7三角烧瓶：普通可加热三角烧瓶。 SN/T 1165.2—20025.8 琼脂糖:分析纯。5.9氯化钠：分析纯。5.10叠氮钠:分析纯。5.11水：符合GB/T析实验室二级水规格。6操作方法6.1琼脂凝胶平板的制备：称取琼脂糖0.9g，氯化钠0.85g，加人100mL蒸馏水，经0.06MPa10min高压或电磁振荡煮沸溶解后，冷却至45℃，加入0.01%叠氮钠。加人融化琼脂，使琼脂板厚度为2.5mm～2.8 mm,待凝固后置 4℃冰箱片刻。6.2打孔:采用七孔制，中间一孔，周围六孔为-组,孔径4 mm,孔间距2.4 mm。6.3加样：中心孔加抗原，一、三、五孔加标准阳性血清；二、四、六孔加被检血清，加样量应以加满孔为原则，加样后置湿盒内于室温(22℃～25℃)下，分别于24 h、48 h和72h观察并记录结果。7 对照每次试验应设阳性对照,弱阳性(将标准阳性血清作 1：4、1：8、1：16 稀释)。8 判定8.1 判定方法将琼脂板置暗背景或侧强光照射下观察，当标准阳性血清与抗原孔之间应出现一条清晰的白色沉淀线，则试验可以成立。若没有沉淀线或不明显，则试验不能成立，应重做。对照成立时，进行判定。24h初判,72h终判。8.2判定标准阳性：被检血清孔与抗原孔之间出现明显清晰致密的沉淀线,并与标准阳性血清孔的沉淀线末端互相融合者,记作“十十”弱阳性：标准阳性血清孔和抗原孔之间的沉淀线向被检血清孔内侧弯曲，而被检血孔与抗原之间不形成完整的沉淀线，记作“十”。可疑：标准阳性血清孔与抗原孔之间出现的沉淀线末端向受检血清孔内侧偏弯或微弯者，记作*士”。阴性：被检血清孔与抗原孔之间无沉淀线，标准阳性血清孔与抗原孔间沉淀线直伸延到被检血清孔边缘，无弯曲者，记作“一”。非特异性反应:抗原孔与被检血清与标准阳性血清的沉淀线交叉，为非特异性反应第一次检查为弱阳性或可疑或非特异性，须重复试验。重复试验仍为弱阳性者判为阳性，重复试验仍